兩種皮氏蛾螺ACE抑制肽的穩(wěn)定性和抑制活性

劉鑫烔,宋鋮鋮,喬變文,付穎寰

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034;2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034;3.大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

高血壓(hypertension)是一種以體外循環(huán)動脈壓升高為特征的臨床綜合征[1-2],是人類最常見的心血管疾病之一。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)屬二肽羧肽酶,在調(diào)節(jié)血壓、維持電解質(zhì)平衡、保護腎臟和血管心肌重塑過程中起著重要作用[3-5]。在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin Angiotensin System,RAS)中,ACE可使血管緊張素I(Ang I)轉(zhuǎn)化為具有收縮血管作用的血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ),后者使血管進一步收縮、血壓升高[6]。近年來,對于治療高血壓疾病已經(jīng)取得顯著效果,其中化學(xué)合成的ACE抑制劑如Lisinopril,Captopril等,在治療高血壓方面已取得較好的效果。但也帶來了一定的副反應(yīng),如,頭暈惡心、干咳、腎毒性水腫、皮疹等,甚至?xí)斐商合忍旎蝃7-8]。近年研究發(fā)現(xiàn),多種天然食物源的活性多肽也具有較好的ACE抑制活性[9],且對人體不產(chǎn)生副作用,已成為研究的熱點。

皮氏蛾螺(Volutharpaampullacealperryi)ACE抑制肽是一種食源性活性多肽,由于其價格便宜易獲得、生理活性強,毒副作用小,是近幾年研究的熱點[10-12]。但是,食源性活性多肽的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,易被外界環(huán)境干擾,造成口服利用率較低,影響其生理活性[13]。一些食源性活性多肽在體外實驗中具有較好的ACE抑制活性,在體內(nèi)卻無明顯抑制作用[14]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能由于多肽經(jīng)過體內(nèi)多種酶的消化作用,使其氨基酸序列肽鏈斷開,結(jié)構(gòu)改變,生物活性喪失[15]。近年來研究顯示,高溫、金屬離子、食鹽濃度都會影響ACE抑制肽活性[16-17]。雄蠶蛾酶解肽(MSH)在鹽度小于4%,溫度低于60 ℃,酸堿度在4～8之間時,MSH表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[18]。因此,食源性ACE抑制肽在不同溫度、金屬離子、鹽、糖和人體的消化吸收對ACE抑制肽穩(wěn)定性和抑制率的影響需進一步驗證。He等[19]研究皮氏蛾螺在煮沸過程中品質(zhì)和感官品質(zhì)的變化,長時間加熱煮沸會使肉質(zhì)變老,口感差。Sun等[20]以Zn-SBA-15固定化ACE作為親和載體,根據(jù)載體與肽親和力的不同分離出兩種ACE抑制肽:Ile-Val-Thr-Asn-Trp-Asp-Asp-Met-Glu-Lys(IVTNWDDMEK)和Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly(VGPAGPRG)。這兩種多肽的降壓機理、生理活性還需要進一步研究。

本文采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測IVTNWDDMEK和VGPAGPRG兩種皮氏蛾螺ACE抑制肽在不同處理條件下的保留率和抑制率,研究其穩(wěn)定性及抗消化性,為探究ACE抑制肽的加工方式和在體內(nèi)的消化過程提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皮氏蛾螺抑制肽Ile-Val-Thr-Asn-Trp-Asp-Asp-Met-Glu-Lys(IVTNWDDMEK)、Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly(VGPAGPRG) 純度均大于98%,委托南京萊昂生物科技有限公司合成;磷酸二氫鉀 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑廠;葡萄糖 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑廠;乙腈 色譜級,Specturm chemical MFG. CORP.。

Waters e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司;熒光酶標儀F200 德國Tecan公司;SunFire C18(5 μm,4.6 mm×150 mm) 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RP-HPLC定量檢測多肽含量 采用Waters e2695高效液相色譜儀,色譜柱為SunFire C18(5 μm,4.6 mm×150 mm);流動相為含0.05%三氟乙酸水溶液(A)和乙腈(B);檢測波長:220 nm;流速1 mL/min;進樣量10 μL。IVTNWDDMEK的檢測條件:流動相A:B為90∶10 (v/v);VGPAGPRG的檢測條件:流動相A∶B為95∶5 (v/v)。

1.2.2 ACE抑制活性的測定 采用Sun等[20]的方法檢測ACE抑制活性,稍作修改。取50 μL馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate,HHL)(5 mmol/L)于1.5 mL離心管中,加入20 μL多肽樣品溶液,充分混勻,37 ℃下恒溫水浴預(yù)熱5 min,預(yù)熱后加入20 μL 0.01 U/mL純ACE酶。37 ℃恒溫水浴保溫60 min后,加入10 μL 0.2 mol/L HCl終止反應(yīng),通過RP-HPLC(水)用Gall 12S05-2546 C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)測定混合物的馬尿酸含量。等度流動相水(0.05%三氟乙酸)∶乙腈在75∶25 (v/v)處的流速為0.5 mL/min,并使用DAD檢測器在228 nm處監(jiān)測流出液。用純凈水做空白對照,根據(jù)公式(1)計算各反應(yīng)液ACE抑制率。

式(1)

式中:A樣品-樣品組馬尿酸的峰面積;A對照-純凈水中馬尿酸的峰面積。

1.2.3 各因素對皮氏蛾螺ACE抑制肽穩(wěn)定性和抑制活性的影響

1.2.3.1 溫度對皮氏蛾螺ACE抑制肽穩(wěn)定性和抑制活性的影響 分別取2.00 mg/mL的多肽溶液于1.5 mL離心管中。分別置于37、60、80、100 ℃下恒溫水浴,分別于0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取100 μL,過0.45 μm水系濾膜后,按照1.2.1的檢測方法對兩種多肽含量進行測定。根據(jù)公式(2)計算ACE抑制肽保留率。再分別于37、60、80、100 ℃處理6 h后取20 μL多肽樣品溶液按照1.2.2的檢測方法公式(1)測定并計算各反應(yīng)液的ACE抑制率。

式(2)

其中:Ab為反應(yīng)后抑制肽峰面積;A0為反應(yīng)前抑制肽的峰面積。

1.2.3.2 金屬離子對皮氏蛾螺ACE抑制肽穩(wěn)定性和抑制活性的影響 取ACE 抑制肽溶液(2 mg/mL,100 μL)分別加入100 μL的5 mmol/L KCl、CaCl2、CuSO4、MgSO4、ZnSO4和FeCl3,在37 ℃下恒溫水浴2 h。過0.45 μm水系濾膜后,按照1.2.1的檢測方法對兩種多肽含量進行測定。根據(jù)公式(2)計算ACE抑制肽保留率。再取100 μL 2.00 mg/mL多肽溶液分別加入100 μL的5 mmol/L KCl、CaCl2、CuSO4、MgSO4、ZnSO4和FeCl3,在37 ℃下恒溫水浴2 h,按照1.2.2的檢測方法和公式(1)測定并計算各反應(yīng)液的ACE抑制率。

1.2.3.3 葡萄糖和NaCl對皮氏蛾螺ACE抑制肽穩(wěn)定性和抑制活性的影響 取ACE抑制肽溶液(2 mg/mL,100 μL)分別加入100 μL的3%、6%、9%、12%的葡萄糖;3%、6%、9%、12%的NaCl,在100 ℃下恒溫水浴振蕩20 min。過0.45 μm水系濾膜后。按照1.2.1的檢測方法對兩種多肽含量進行測定。根據(jù)公式(2)計算ACE抑制肽保留率。再取100 μL 2.00 mg/mL多肽溶液分別加入100 μL的3%、6%、9%、12%的葡萄糖;3%、6%、9%、12%的NaCl,在100 ℃下恒溫水浴振蕩20 min,按照1.2.2的檢測方法和公式(1)測定并計算各反應(yīng)液的ACE抑制率。

1.2.3.4 胃蛋白酶消化實驗 胃蛋白酶消化實驗參照Tavares等[21]的方法,稍作修改進行測定。分別取2 00 μL 2.00 mg/L ACE抑制肽溶液,1800 μL人工胃液(取稀鹽酸16.4 mL,胃蛋白酶10 g,用蒸餾水定容至1 L。稀鹽酸溶液中含9.5%～10.5%的HCl)于2 mL離心管中,37 ℃下恒溫水浴,分別于0、30、60、90、120 min取200 μL,向其中加入37 μL 0.5 mol/L NaOH中和至pH=7.0,100 ℃恒溫水浴10 min滅酶,過0.45 μm水系濾膜后,按照1.2.1的檢測方法對兩種多肽含量進行測定。根據(jù)公式(2)計算ACE抑制肽保留率。再分別取2.00 mg/mL多肽溶液及在胃液處理0、30、60、90、120 min時的反應(yīng)液,按照1.2.2的檢測方法和公式(1)測定并計算各反應(yīng)液的ACE抑制率。

1.2.3.5 胰蛋白酶消化試驗 胰蛋白酶消化實驗參考《中國藥典》2015版[22]的方法測定,稍作改動。分別取200 μL 2.00 mg/L ACE抑制肽溶液,1800 μL人工腸液(稱取磷酸二氫鉀3.4 g,用250 mL蒸餾水溶解,用NaOH(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)pH為6.8;稱取2.5 g胰蛋白酶,用100 mL蒸餾水溶解,混合兩種溶液并定容至500 mL)于2 mL離心管中,37 ℃下恒溫水浴,分別于0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取200 μL,100 ℃恒溫水浴10 min滅酶,過0.45 μm水系濾膜后,按照1.2.1的檢測方法對兩種多肽含量進行測定。根據(jù)公式(2)計算ACE抑制肽保留率。再分別取2.00 mg/mL多肽溶液及在腸液中處理0、0.5、1、2、3、4、5、6 h時的反應(yīng)液,按照1.2.2的檢測方法和公式(1)測定并計算各反應(yīng)液的ACE抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以三個平行樣本的平均值±標準差(M±SD)表示,并使用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析,P<0.05表示數(shù)據(jù)存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種皮氏蛾螺ACE抑制肽熱穩(wěn)定性和抑制活性

ACE抑制肽熱穩(wěn)定性的影響如圖1所示。十肽IVTNWDDMEK穩(wěn)定性最佳溫度是37和60 ℃,在80 ℃時,隨著處理時間的延長,6 h后多肽保留率下跌了20%,在100 ℃時,隨著處理時間的延長,6 h后多肽保留率下跌75%,八肽VGPAGPRG穩(wěn)定性較好,能夠長時間抵抗高溫加熱。十肽IVTNWDDMEK的熱失活分為兩步,首先是二聚體分解成單個亞基,然后亞基發(fā)生不可逆變性[23-24]。然而,不同的肽鏈長度或氨基酸組成與連接蛋白的引入可能會改變蛋白質(zhì)的拓撲結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。因此,在多肽的加工過程中應(yīng)控制好溫度,盡量避免高溫環(huán)境。

圖1 溫度對IVTNWDDMEK(A)和VGPAGPRG(B)的熱穩(wěn)定性影響

經(jīng)過不同溫度條件處理后的兩種皮氏蛾螺ACE抑制肽的抑制活性結(jié)果如圖2所示,盡管IVTNWDDMEK多肽在80 ℃和100 ℃高溫下的穩(wěn)定性差,但是ACE抑制活性不僅沒有降低,反而增加了,這可能是因為肽鏈在高溫下分解,分解成小肽產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),從而提高ACE抑制活性。多肽VGPAGPRG在不同的溫度下均有良好的穩(wěn)定性,但在80 ℃和100 ℃處理時ACE抑制活性略有下降,在100 ℃加熱6 h之后,活性保留率為94%左右,這可能是由于在高溫使肽鏈被破壞從而抑制其活性。Escudero等[25]從香腸中分離出的17種ACE抑制肽,經(jīng)過117 ℃加熱6 min,僅有三種能夠保持原來的抑制活性。醋蛋多肽ACE抑制活性的保持率隨著溫度的升高而降低,當溫度達到100 ℃時,活性保留率為60%左右。因此,本實驗研究的皮氏蛾螺酶解肽在高溫下有較好的穩(wěn)定性。

圖2 溫度對IVTNWDDMEK(a) 和VGPAGPRG(b)抑制率的影響

2.2 金屬離子對皮氏蛾螺ACE抑制肽穩(wěn)定性和抑制活性的影響

食品在加工、儲存和運輸過程中,難免會接觸到各種金屬離子,不僅會影響食品的色澤,還會影響食品的風味品質(zhì)。本實驗采用不同金屬離子處理多肽,結(jié)果如圖3所示。在相同濃度K+、Mg2+、Cu2+、Ca2+對IVTNWDDMEK穩(wěn)定性無顯著影響(P<0.05),Zn2+、Fe3+可影響多肽的穩(wěn)定性。在Fe3+存在時,IVTNWDDMEK保留率為93.83%;鉀離子是維持體液滲透壓和心臟功能的重要離子。K+、Mg2+不影響ACE抑制活性,而Cu2+、Ca2+可顯著增強ACE抑制活性。在Ca2+存在時,IVTNWDDMEK抑制率為85.53%。Fe3+可使IVTNWDDMEK對ACE抑制活性大大降低,抑制率僅為11.15%。Zn2+的添加增強了IVTNWDDMEK對ACE的抑制活性,添加了Zn2+的IVTNWDDMEK對ACE抑制活性為97.65%,VTNWDDMEK可以通過抑制鋅離子與ACE結(jié)合,從而顯著抑制ACE活性。

圖3 金屬離子對IVTNWDDMEK和VGPAGPRG穩(wěn)定性(A)和ACE抑制活性(B)的影響

Zn2+和Fe3+存在時會使VGPAGPRG對ACE抑制活性大大降低,VGPAGPRG的抑制率分別為11.16%、17.19%。其原因可能是鋅離子是ACE酶的輔酶,添加Zn2+可以提高ACE的活性,從而降低多肽的抑制活性,在Fe3+存在時,VGPAGPRG的保留率為97.04%,在Ca2+存在時,VGPAGPRG的抑制率為81.24%;在Cu2+存在時,IVTNWDDMEK抑制率為92.63%,VGPAGPRG的抑制率為84.66%;Cu2+、Ca2+可與多肽結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同作用,從而增強抑制活性。而Fe3+可以與多肽側(cè)鏈基團相結(jié)合,改變肽的化學(xué)結(jié)構(gòu),從而使多肽的抑制活性降低。楊峰等[26]研究表明K+、Zn2+對醋蛋多肽ACE抑制活性影響較大,分別為65%、70%。因此,在制備多肽時,可以加入適當?shù)腃u2+、Ca2+的同時避免與Fe3+接觸。

2.3 高濃度的葡萄糖和NaCl對皮氏蛾螺ACE抑制肽穩(wěn)定性的影響

糖和鹽是最常見的食物成分。糖主要影響食物的風味、味道、顏色等感官品質(zhì)。高濃度的糖也是一種食品防腐劑。還原糖和氨基酸在加熱條件下發(fā)生美拉德反應(yīng),賦予食物獨特的風味。醫(yī)學(xué)研究證明高血壓的發(fā)生與長期攝入高濃度鹽有關(guān)[27]。本實驗采用葡萄糖和氯化鈉對多肽的穩(wěn)定性和ACE的抑制活性進行了研究,結(jié)果如圖4所示。總體上來看IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的穩(wěn)定性和抑制率會隨著葡萄糖濃度和氯化鈉濃度的升高而有所降低,當葡萄糖濃度為3%時IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的保留率和抑制率分別為96%、94.9%、83.2%、76.8%。但當葡萄糖濃度達12%時,IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的保留率分別為94.2%,90.7%,ACE抑制率降低為68.9%和54.5%,可見糖濃度的增加對ACE抑制肽的抑制率影響較大。

圖4 葡萄糖對IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的穩(wěn)定性(A)和ACE抑制活性(B)的影響

如圖5所示,當鹽濃度為3%時,IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的保留率和抑制率分別為98.48%、98.13%、77.6%和73.2%,但當食鹽濃度為12%時,IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的穩(wěn)定性分別為92.5%,67.9%。抑制率降為55.9%和59.4%,對ACE抑制率影響較大。陳季旺等[28]研究發(fā)現(xiàn)一定量的NaCl對魚降壓肽ACE抑制活性影響不大,當NaCl濃度較高時,明顯影響魚降壓肽ACE抑制活性。因此食鹽對兩種ACE抑制肽的抑制活性有影響,特別是較高濃度的食鹽。所以在加工過程中應(yīng)避免與較高濃度的食鹽和較高濃度的糖接觸。

圖5 NaCl對IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的穩(wěn)定性(A)和ACE抑制活性(B)的影響

2.4 皮氏蛾螺ACE抑制肽在人工胃液和模擬腸液中的穩(wěn)定性和抑制活性

ACE抑制肽在消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性如圖6所示。八肽VGPAGPRG具有較高的抗消化能力,在胃液環(huán)境中穩(wěn)定性好,120 min后多肽保留率達95%,然而,VGPAGPRG在腸道液體環(huán)境中穩(wěn)定性較差,6 h后多肽保留率僅為65%。IVTNWDDMEK在胃腸環(huán)境中穩(wěn)定性差,在胃液中消化迅速,120 min后多肽損失75%～85%,多肽保留率僅為33%。VGPAGPRG在胃液環(huán)境中不被消化,在腸液環(huán)境中緩慢降解,這通常是最理想的膳食形式,多肽的消化吸收與多種功能和健康益處相關(guān),包括抑制血壓、抗癌、降血糖、抑制脂肪堆積、增強維生素和礦物質(zhì)吸收[29-30]。肽的消化率受氨基酸類型的影響很大,這取決于肽的理化特性以及氨基酸的序列和組成。十肽中所含的芳香族氨基酸Tyr(酪氨酸)殘基可能是其在胃液中不穩(wěn)定的主要原因,八肽在腸液中易被降解可能是由于含有Arg(精氨酸)殘基,具體消化結(jié)果仍需進一步實驗驗證。

圖6 IVTNWDDMEK和VGPAGPRG在人工胃液(A)和模擬腸液(B)中的穩(wěn)定性

胃液中VGPAGPRG相對穩(wěn)定,ACE抑制活性略有降低。IVTNWDDMEK和VGPAGPRG在胃液2 h和腸液6 h的抑制率分別為30.47%、15.74%、28.01%、12.33%。可能是肽酶水解的肽鏈破壞了肽鏈,抑制了肽鏈的活性。IVTNWDDMEK多肽在胃液中的穩(wěn)定性較差,但仍能保持良好的ACE抑制活性。這兩種多肽在胃腸液中相對較弱,其ACE抑制活性有所降低,這可能是由于蛋白水解多肽、肽鏈斷裂、活性受到抑制所致。

圖7 胃液和腸液反應(yīng)6 h后IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的ACE抑制活性

3 結(jié)論

本文以兩種皮氏蛾螺ACE抑制肽為研究對象,通過反相高效液相色譜技術(shù)測定兩種皮氏蛾螺酶解肽的熱穩(wěn)定、抗胃腸道消化吸收能力、金屬離子穩(wěn)定性和高鹽、高糖的穩(wěn)定性和抑制活性。實驗結(jié)果表明,長時間高溫100 ℃加熱,會改變多肽的穩(wěn)定性,使肽鍵斷裂,降低生理活性。通過模擬體外胃腸消化,兩種多肽在體內(nèi)的經(jīng)過2 h胃液和6 h腸液的消化吸收,酶解肽一定程度被分解成小分子多肽,但分解后仍具有ACE抑制活性。金屬離子和Fe3+的添加會降低ACE抑制活性,鋅離子是ACE酶的輔酶,Zn2+可能與多肽的側(cè)鏈基團結(jié)合,影響其抑制活性。在37、60、80 ℃溫度下6 h內(nèi)兩種ACE抑制肽均有較好的熱穩(wěn)定性,其中VGPAGPRG表現(xiàn)最優(yōu)的穩(wěn)定性。經(jīng)人工胃液反應(yīng)2 h后和人工腸液反應(yīng)6 h后,八肽VGPAGPRG穩(wěn)定性要好于十肽IVTNWDDMEK。雖然這兩種肽經(jīng)過胃腸液的消化,穩(wěn)定性降低,多肽分解成小分子物質(zhì),但仍然具有ACE抑制活性,說明進入體內(nèi)可以被良好的消化吸收,并且還具有ACE抑制活性。在金屬離子中的穩(wěn)定性較好,但是鐵離子會抑制ACE抑制活性,在添加時要注意避免添加包含F(xiàn)e3+離子的物質(zhì),高鹽和高糖也會影響ACE抑制效果。IVTNWDDMEK和VGPAGPRG具有較好的熱、離子、高鹽、高糖穩(wěn)定性和良好的抗胃腸道消化吸收能力。為研究ACE抑制肽的生物口服利用度提供了理論基礎(chǔ)。