人參山羊奶粉緩解體力疲勞作用及其標志性成分含量測定

韓燕燕,吳 巍,王悅宏,李 慧,陳 雪,李曼微,王恩鵬,*,陳長寶,*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院,吉林長春 130117;2.吉林建筑大學(xué)松遼流域水環(huán)境教育部重點實驗室,吉林長春 130118)

疲勞是指腦力或體力到達一定階段時必然出現(xiàn)的一種生理現(xiàn)象[1-4],有數(shù)據(jù)表明,全球目前有35%以上的人處于疲勞狀態(tài),其中男性占60%,且常伴有運動性疲勞,屬于中醫(yī)腎虛證的主要證候[5-10]。一旦疲勞不能及時恢復(fù),將導(dǎo)致機體內(nèi)分泌紊亂、免疫力下降,是威脅人類健康的重要因素[11-12]。

人參作為百草之王,是公認的藥食兩用的補益類藥材,具有優(yōu)異的抗疲勞功能[13-19],其活性成分主要為人參皂苷、多糖等[20-23],可通過清除自由基、調(diào)節(jié)糖代謝、減少乳酸堆積、抗中樞神經(jīng)遞質(zhì)紊亂等方面緩解體力疲勞[24,25]。山羊奶是世界上公認的最接近人奶的乳品,有“奶中之王”的美譽,富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪及脂肪酸等[26-27]。《本草綱目》中記載:“羊乳,甘溫無毒,補寒冷虛乏,潤心肺,治消渴,療虛癆,益精氣,補肺腎氣,和小腸氣,補腎虛,利大腸”[28-29]。目前國內(nèi)外開發(fā)的山羊奶產(chǎn)品種類繁多,主有嬰幼兒配方奶粉、酸奶、奶酪等產(chǎn)品,功能涉及降壓、降脂、降血糖及益智健腦、美容養(yǎng)顏等方面[30-31],然而將二者結(jié)合開發(fā)成具有抗疲勞功效的保健食品則鮮有報道。

高分離快速液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(rapid resolution liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry,RRLC-Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)具有高分辨、高質(zhì)量精度等諸多優(yōu)點,特別適用于復(fù)雜體系中活性成分的定性及定量分析[32-35]。本文旨在開發(fā)一種將人參、山羊奶結(jié)合的保健食品,為申報前期的功能性評價及含量測定提供參考,為合理開發(fā)利用人參及山羊奶資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干法制人參山羊奶粉、濕法制人參山羊奶粉、人參超微粉 由黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司提供;標準品:Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rd(純度>98%) 均購自南京澤朗有限公司;ICR雄性小鼠 購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司,動物合格證號:SCXK-(遼)2015-0001;尿素氮試劑盒、血清乳酸脫氫酶測定試劑盒、全血乳酸試劑盒 購自南京建成生物工程研究所;羧甲基纖維素鈉 購自天津光復(fù)精細化工研究所;氫化可的松注射液 購自國藥集團容生制藥有限公司(國藥準字H20023069);其它試驗用試劑及材料 北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

Tecan infinite M200 Pro型酶標儀 瑞士帝肯公司;ES-100A型電子天平 沈陽龍騰電子儀器公司;AG 22331高速冷凍離心機 德國EPPendorf公司;Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器 美國SI公司;Bio-Gen PRO 200型精密勻漿器 美國PRO Scientific公司;電熱恒溫水浴箱 北京長安科學(xué)儀器廠;超聲提取KQ-3200B 昆山市超聲儀器有限公司;真空泵 SHB-3 鄭州杜甫儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100 日本東京理化;Aglient 6520液質(zhì)聯(lián)用儀 Aglient1200型液相色譜系統(tǒng) Aglient accurate6520(Q-TOF)四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀 美國Aglient公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參山羊奶粉人參皂苷含量測定

1.2.1.1 標準品溶液的制備 分別取Rg1,Re,Rb1,Rb2,Rc和Rd標準品適量,精密稱定,加適量甲醇溶解并定容至刻度,分別制成濃度為1 mg/mL標準品溶液[36]。

1.2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取人參超微粉1 g,記為G1、G2、G3;分別精密稱取干法奶粉和濕法人參山羊奶粉各16.84 g,共三份,分別記為DP-1,DP-2,DP-3和WP-1,WP-2,WP-3。同時為驗證空白奶粉中皂苷含量,精密稱取空白奶粉15.84 g,共3份,記為P-1、P-2、P-3。將上述樣品分別置于250 mL具塞三角瓶中,加入70%的甲醇適量,超聲提取兩次,合并提取液,減壓濃縮并定容至50 mL。將樣品轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中,加適量乙醚,萃取3 次,棄去乙醚層。再加入適量水飽和正丁醇溶液,萃取3 次,合并正丁醇層,于60 ℃水浴揮干。用適量甲醇溶解并定容至10 mL,過0.45 μm微孔濾膜,待進樣分析。

1.2.1.3 色譜條件 色譜柱:Sigma-Aldrich C18色譜柱(50 mm×3.0 mm,2.7 μm);采用二元線性梯度洗脫:以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動相;梯度洗脫:0～5 min,15%～19% B;5～10 min,19% B;10～28 min,19%～26% B;28～30 min,26%～60%;流速為0.5 mL/min,柱溫35 ℃,進樣量5 μL[36]。

1.2.1.4 質(zhì)譜條件 采用負離子模式,掃描范圍m/z 200～1500。離子源為電噴霧電離源(ESI),霧化氣溫度300 ℃,干燥氣(N2)流速9 L/min,干燥氣溫度350 ℃;霧化器壓力45 Psi[36]。

1.2.1.5 標準曲線的建立 取6種標準品溶液,稀釋成濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50 μg/mL的標準品系列溶液,在1.2.3和1.2.4條件下,進樣分析,記錄色譜圖提取離子流峰面積定量。以濃度為橫坐標(X),相應(yīng)生成的峰面積為縱坐標(Y),做線性回歸分析,作回歸方程,得到六種皂苷單體標準品的回歸方程及決定系數(shù)分別為:Rg1(Y=58000X+13312,R2=0.9926),Re(Y=60481X-60643,R2=0.9994),Rb1(Y=46203X+23465,R2=0.9994),Rb2(Y=12847X+6524.7,R2=0.9981),Rc(Y=14994X+6718.5,R2=0.9998),Rd(Y=41452X+23932,R2=0.9995)。

1.2.2 動物分組及給藥劑量 在標準環(huán)境下(濕度50%±10%;溫度25±2 ℃;12 h晝夜循環(huán))自由進食進水,適應(yīng)性喂養(yǎng) 3 d 后,按體重隨機為空白組、模型組、人參山羊奶粉低(1.580 g/kg)、中(3.167 g/kg)、高劑量(6.333 g/kg),每組15只;灌胃給藥,每天一次,其中低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量干法制人參山羊奶粉,空白組及模型組按體重給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液,連續(xù)灌胃給藥30 d;在給藥第26～29 d,皮下注射氫化可的松50 mg/kg,制備腎虛動物模型。

1.2.3 負重游泳實驗 末次給藥50 min后,將尾根部負荷7%體重鉛皮的小鼠置于水深25 cm,水溫(28±1.0) ℃的游泳箱內(nèi),記錄小鼠自游泳開始至下沉10 s不再浮上來的時間,即為負重游泳時間[37]。

1.2.4 爬桿時間實驗 末次給藥50 min后開始試驗,將小鼠放到玻璃棒上,使肌肉處于靜力緊張狀態(tài),記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌落下來的時間,累計3次,即為爬桿時間。

1.2.5 尿素氮(BUN)和丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力測定 參考文獻[38-39],末次給藥50 min后,將小鼠置于水溫為28 ℃游泳缸中不負重游泳60 min,休息40 min后,摘眼球取血,離心,取血清,按測試盒說明書測定BUN和MDA含量及SOD活力。

1.2.6 血乳酸(LA)含量測定 參考文獻[38],末次給藥30 min后,采血20 μL,在30 ℃水中不負重游泳10 min后采血20 μL,休息20 min后采血20 μL,目內(nèi)眥取血,不加抗凝,按試劑盒要求測定3個時間點的LA含量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)以Excel建立數(shù)據(jù)庫,利用GraphPad Prism作圖,采用SPSS統(tǒng)計軟件進行處理。組間差異比較用ANOVA 及Newman-Student 多重比較t檢驗分析,由SPSS 21.0統(tǒng)計軟件完成。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品6種主要皂苷的含量測定及鑒別

在1.2.1.3和1.2.1.4條件下,取1.2.1.2項下樣品進行質(zhì)譜分析,各色譜峰分離度良好,各樣品總離子流圖,見圖1;以標準品進行比對并串聯(lián)離子碎片進行定性,串聯(lián)離子碎片信息見表1,串聯(lián)離子碎片質(zhì)譜圖見圖2,與已報道文獻結(jié)果一致[40];提取離子流峰面積定量,帶入1.2.1.5項下相應(yīng)標準曲線中;結(jié)果,干法制人參山羊奶粉中6種主要皂苷含量為0.09～0.24 mg/g,濕法制人參山羊奶粉中6種主要皂苷含量為0.07～0.19 mg/g;由表2可知,干法制人參山羊奶粉中6種主要皂苷含量均略高于濕法制人參山羊奶粉,可能是由于在濕法制備過程中,在噴霧干燥工藝中,受高溫影響,皂苷結(jié)構(gòu)被破壞或發(fā)生轉(zhuǎn)化[41]。故選擇干法制備人參山羊奶粉。

表1 不同奶粉樣品中6種主要皂苷鑒定結(jié)果

圖1 人參總離子流色譜圖

表2 六種皂苷單體含量測定的結(jié)果

圖2 在負離子模式下獲得的人參皂苷的MS/MS譜圖

2.2 對小鼠負重游泳時間的影響

由實驗結(jié)果可知,與空白組相比,腎虛模型組小鼠負重游泳時間極顯著縮短(P<0.01)。與腎虛模型組相比,組方低、中、高劑量均能明顯延長小鼠負重游泳時間(P<0.05或P<0.01),結(jié)果見表3。

表3 小鼠負重游泳時間試驗結(jié)果

2.3 對小鼠爬桿時間的影響

由實驗結(jié)果知,與空白組相比,腎虛模型組小鼠爬桿時間極顯著縮短(P<0.01)。與腎虛模型組相比,組方低、中、高劑量均能顯著延長小鼠爬桿時間(P<0.05或P<0.01),結(jié)果見表4。

表4 小鼠爬桿時間試驗結(jié)果

2.4 對小鼠血清丙二醛(MDA)含量的影響

由實驗結(jié)果可知,與空白組相比,腎虛模型組小鼠血清MDA含量顯著升高(P<0.05)。與腎虛模型組相比,組方低劑量有降低小鼠血清MDA含量的趨勢(P>0.05);組方中、高劑量能顯著降低小鼠血清MDA含量(P<0.05),結(jié)果見圖3。

圖3 小鼠血清丙二醛(MDA)含量試驗結(jié)果

2.5 對小鼠血清尿素氮(BUN)含量的影響

由實驗結(jié)果可知,與空白組相比,腎虛模型組小鼠血清BUN含量升高(P<0.05)。與腎虛模型組相比,組方低劑量有降低小鼠血清BUN含量的趨勢(P>0.05);組方中、高劑量均能降低小鼠血清BUN含量(P<0.05或P<0.01),見圖4。

圖4 小鼠血清尿素氮(BUN)含量試驗結(jié)果 Fig.4 Results of the content of blood urea nitrogen of mice

2.6 對小鼠超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

由實驗結(jié)果可知,與空白組相比,腎虛模型組小鼠血清SOD活力顯著降低(P<0.01)。與腎虛模型組相比,組方低劑量有升高小鼠血清SOD活力的趨勢(P>0.05);組方中、高劑量能顯著升高小鼠血清SOD活力(P<0.05或P<0.01),結(jié)果見圖5。

圖5 小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活力試驗結(jié)果

2.7 對小鼠游泳10 min后和游泳休息20 min后血乳酸(LA)含量的影響

由實驗結(jié)果可知,小鼠游泳10 min后,與空白組相比,腎虛模型組小鼠LA含量升高(P>0.05);與腎虛模型組相比,組方低劑量有降低小鼠LA含量的趨勢(P>0.05);組方中、高劑量均能降低小鼠LA含量(P<0.05)。小鼠游泳休息20 min后,與腎虛模型對照組相比組方高劑量能顯著降低小鼠LA含量(P<0.05),見表5。

表5 小鼠游泳后血乳酸含量試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

人參是我國傳統(tǒng)的滋補藥材,主要的化學(xué)成分是人參皂苷[42]。劉娜[43]等研究發(fā)現(xiàn),在連續(xù)28 d灌胃給予正常小鼠人參皂苷(3.2、1.6、0.8 g/kg)后,人參皂苷能夠顯著延長小鼠的負重游泳時間,降低小鼠體內(nèi)尿素氮、乳酸及丙二醛的含量,提高肝糖原在體內(nèi)的儲備等,具有良好的抗疲勞作用。并且西歐一些科學(xué)家稱山羊奶是天然抗生素,常喝山羊奶可使人面色紅潤、體力充沛[44]。

在本實驗中利用RRLC-Q-TOF-MS檢測技術(shù)對干、濕法奶粉中6種主要的皂苷類活性成分-Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc和Rd 進行含量測定,其中干法奶粉中6種皂苷含量為0.09～0.24 mg/g,濕法奶粉中6種皂苷含量為0.07～0.19 mg/g,干法制人參山羊奶粉中皂苷含量相對更高一些,故選擇干法制人參山羊奶粉。并依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部2003年版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中“緩解體力疲勞功能檢驗方法”的要求進行實驗設(shè)計。研究發(fā)現(xiàn),與模型組相比,組方低、中、高劑量均能明顯延長腎虛模型小鼠負重游泳時間和爬桿時間(P<0.05或P<0.01);組方中、高劑量能顯著降低小鼠血清MDA含量(P<0.05)及BUN含量(P<0.05或P<0.01),能顯著升高小鼠血清SOD活力(P<0.05或P<0.01),能降低小鼠游泳10 min后LA含量(P<0.05),組方高劑量能顯著降低小鼠游泳20 min后LA含量(P<0.05);表明人參山羊奶可以提高腎虛模型小鼠的運動耐力,降低靜用力時疲勞,提高有氧代謝能力,改善運動時骨骼肌的功能,具有緩解腎虛型體力疲勞的作用,與已報道的相關(guān)研究結(jié)果基本一致[43]。

綜上所述,本文的研究內(nèi)容可為人參山羊奶抗疲勞保健食品的開發(fā)及其標志性成分含量測定提供參考。