3種不同溶劑中根皮苷與牛血紅蛋白的相互作用及抗氧化性

高義霞,楊 艷,周向軍

(1.天水師范學院生物工程與技術學院,甘肅天水 741001;2.甘肅省大櫻桃工程技術研究中心,甘肅天水 741001)

根皮苷(phlorizin,PHL)是根皮素與2′-β-D-葡萄糖形成的二氫查爾酮苷類化合物[1],富含于蘋果、梨、荔枝和多穗柯甜茶等組織的嫩葉、根莖及蘋果果實中[2]。研究表明,根皮苷是鈉-葡萄糖轉運蛋白(SGLTs)的競爭性抑制劑[3],可減輕Ⅲ型糖尿病的胰島素抵抗,同時也可促進葡萄糖的外排分泌,降低餐后血糖水平而不產生低血糖等副作用,因而對糖尿病及并發癥有良好的防治作用。同時,PHL還具有保護心血管[4]、抗病毒[5]、抗感染[6]和抗氧化[7]等多種功能。

光譜法是研究蛋白質與小分子化合物相互作用的主要手段,主要有紫外光譜法、熒光光譜法和紅外光譜法等[8]。每種光譜法均有一定局限性,應盡可能結合上述方法進行研究。通過紫外光譜,可判斷蛋白質分子中芳香族氨基酸的微環境變化,分析蛋白質與小分子是否存在相互作用;通過熒光光譜,可計算出兩者的結合常數和結合位點數,判斷結合位置和作用力類型等;通過同步熒光光譜,可克服Trp、Tyr和Phe發射光譜重疊問題,從而獲得更為清晰的熒光圖譜;通過紅外光譜,可分析蛋白質與小分子化合物作用后二級結構的變化。

血紅蛋白是高等生物紅細胞內執行輸氧功能的呼吸蛋白,常作為血液緩沖劑或通過可逆結合多種配體來調節各種生命現象。牛血紅蛋白(bovine hemoglobin,BHb)與人血紅蛋白具有極高的一級結構同源性,空間結構幾乎完全一致且容易獲得,因此常用于模擬生物大分子與小分子化合物的相互作用研究。小分子化合物與血紅蛋白的相互作用,不僅影響其體內濃度、循環、分布和生物活性等[9],而且對血紅蛋白結構和功能發揮也有一定影響[10],最終影響藥物的治療效果。近年來國內外相關研究主要集中在牛血清蛋白或單一溶劑體系,少有采用血紅蛋白或多溶劑體系的報道。但一方面,由于高濃度PHL的水溶性較差,在食品醫藥領域常需添加乙醇(EtOH)、二甲基亞砜(DMSO)等助溶劑[11],另一方面,小分子化合物與蛋白質的相互作用對其抗氧化性影響也不明確。因此,本實驗利用紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜和紅外光譜法,研究在dH2O、10% DMSO(v/v)和10% EtOH(v/v)不同溶劑體系中,根皮苷與牛血紅蛋白的作用類型、猝滅機理、結合位點數及結合距離等,并分析PHL-BHb對DPPH和ABTS自由基清除率的影響,為研究小分子化合物與血紅蛋白的相互作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血紅蛋白(BHb) 純度>90%,Worthingtong Biochemical Corporation;根皮苷(PHL) 純度>98%,索萊寶;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽) Sigma;DMSO和EtOH 生工生物工程(上海)股份有限公司;實驗用水 娃哈哈純凈水。

RF5301熒光光譜儀、UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津;Nicolet iS5紅外光譜儀 美國賽默飛世爾;PHS-3D型pH計 上海雷磁;ME204電子天平 瑞士梅特勒托利多。

1.2 實驗方法

1.2.1 3種不同溶劑體系中PHL對BHb紫外光譜的影響 在dH2O、10%DMSO和10%EtOH不同溶劑體系中,固定BHb終濃度為1.0×10-5mol·L-1,調節PHL用量使其終濃度分別為0、1.5×10-5、4.5×10-5、7.5×10-5、10.5×10-5、13.5×10-5mol·L-1,在298 K條件下混合均勻,20 min后在240～360 nm范圍內測定紫外吸收光譜[12]。

1.2.2 3種不同溶劑體系中PHL對BHb熒光光譜的影響 在dH2O、10% DMSO和10% EtOH不同溶劑體系中,固定BHb終濃度為1.0×10-5mol·L-1,調節PHL用量使其終濃度分別為0、1.5×10-5、4.5×10-5、7.5×10-5、10.5×10-5、13.5×10-5mol·L-1,混合均勻,20 min后在激發波長280 nm,激發狹縫和發射狹縫均為5 nm,掃描速率1200 nm/min條件下,在300～400 nm范圍內分別測定298、304和310 K時熒光發射光譜[13]。在298 K條件下,固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm,其它參數同熒光光譜,分別測定298 K時BHb的同步熒光光譜[14]。

1.2.3 BHb、PHL-BHb的紅外光譜 在dH2O體系中,固定PHL濃度為1.0×10-4mol·L-1,BHb濃度為1.0×10-4mol·L-1。相互作用20 min后真空冷凍干燥24 h。取2 mg樣品與200 mg KBr進行研磨后壓成透明薄片,在分辨率為4 cm-1,掃描次數為16次,4000～400 cm-1范圍內掃描其紅外光譜。

1.2.4 3種不同溶劑體系中PHL、BHb、PHL-BHb抗氧化性 DPPH自由基清除率參考Sharma[15]方法,研究在3種不同溶劑體系下,PHL和BHb分別為1.5×10-2mol·L-1和1.5×10-5mol·L-1時,其對PHL抗氧化性的影響;ABTS+·清除率參考封易成[16]方法,研究在3種不同溶劑體系下,PHL和BHb分別為1.5×10-2mol·L-1和1.5×10-3mol·L-1時,其對PHL抗氧化性的影響。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 紫外光譜

在3種不同溶劑體系中,PHL與BHb相互作用的紫外光譜見圖1(a)、1(b)和1(c)。由圖1(a)、1(b)和1(c)可知,隨PHL濃度不斷增加,BHb在280 nm附近均逐漸出現增色效應,但這僅表明PHL與BHb存在相互作用[17],不能完全歸屬于BHb分子中Tyr和Trp的π-π*和n-π*躍遷,因為PHL的λmax也在284 nm[18]左右且與BHb紫外吸收存在一定程度重合。在3種不同溶劑體系中,BHb的λmax均發生輕微紅移?？赡茉?PHL與BHb分子間的相互作用,導致π-π*躍遷所需能量減少[19],因而出現紅移。當PHL濃度增至7.5×10-5mol·L-1時,BHb分子在330 nm附近均逐漸出現微弱副峰,這進一步驗證了PHL與BHb存在相互作用。

圖1 3種不同溶劑體系中PHL-BHb的紫外光譜

2.2 熒光光譜

2.2.1 熒光光譜 在3種不同溶劑體系中,PHL與BHb相互作用的熒光光譜見圖2(a)、2(b)和2(c)。理論上采用280 nm波長激發時,Phe熒光發射可忽略,Tyr熒光峰應在313 nm附近,但本實驗313 nm處未見熒光峰,而在320 nm附近出現熒光峰。可能原因:盡管每個BHb分子含有10個Tyr殘基和6個Trp殘基,但BHb疏水腔內的β-37Trp為其內源熒光的主要來源[20],因此,可能是BHb分子發生了Tyr到Trp的能量轉移,從而導致Tyr熒光猝滅和Trp熒光增強。在3種不同溶劑體系中,隨PHL濃度不斷增加,一方面,BHb熒光峰在320 nm附近逐漸變寬甚至消失;熒光強度成規律性降低,且降低程度逐漸減弱。這表明PHL對BHb發生了熒光猝滅,且BHb分子中可被PHL結合的位點被不斷占據而最終使熒光猝滅程度趨于穩定[21]。當PHL濃度增至7.5×10-5mol·L-1時,3種不同溶劑體系中的BHb熒光峰出現峰裂分,即原來320 nm處的單峰逐漸裂分為極其微弱的二重峰,其中一個峰紅移至340 nm附近,可認為是Trp的發射峰;另一個峰藍移至315 nm附近,可認為是Tyr的發射峰。對于熒光二重峰歸屬問題,目前尚無明確定論,初步認為:隨PHL濃度增大(>7.5×10-5mol·L-1),BHb分子中Tyr殘基受PHL誘導而終止與Trp殘基的能量共振轉移,從而發射Tyr熒光峰的趨勢逐漸增強[22]。

圖2 3種不同溶劑體系中PHL-BHb熒光光譜

在dH2O體系中,隨PHL濃度增大,BHb的λem由321 nm逐漸紅移至349 nm;在10% DMSO體系中,BHb的λem由321 nm逐漸紅移至350 nm;在10% EtOH體系中,BHb的λem由322 nm逐漸紅移至349 nm。一般認為,Trp處于非極性介質時,熒光峰在310～324 nm范圍;處于分子內部疏水介質時,熒光峰在326～332 nm范圍;暴露分子表面時,熒光峰在350～353 nm范圍[23]。本實驗結果表明,3種不同溶劑體系中的Trp處于從疏水性介質向分子表面暴露階段,即部分位于疏水介質中。PHL分子中存在的給電子基團-OH,可誘導BHb發生紅移,這是分子內電荷轉移而引起的能量轉移結果[24]。

2.2.2 熒光猝滅機理 假設PHL對BHb的熒光猝滅為動態猝滅,根據Stern-Volmer曲線擬合:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

式(1)

式(1)中:F0和F分別為未加和加入PHL時的熒光強度,[Q]為PHL濃度,Kq為速率常數,τ0為無PHL時熒光壽命(10-8s),Ksv為猝滅常數。

lg[(F0-F)/F]=nlg[Q]+lgKa

式(2)

式(2)中:n為結合位點數,Ka為結合常數。

根據PHL濃度及熒光強度,計算KSV、Kq、Ka等,結果見表1。在3種不同溶劑體系中,Kq均為1012L·(mol·S)-1數量級且大于2.0×1010L·(mol·S)-1,故PHL對BHb為靜態猝滅[25]。在3種不同溶劑體系中,平均結合位點數(n)分別為1.57、1.58和1.57,n和Ka均隨溫度升高而降低,這表明溫度升高降低了PHL-BHb穩定性,符合靜態猝滅。3種不同溶劑體系中,Ka均為107L·mol-1數量級,表明理論上PHL與BHb的結合作用較強[26],可被蛋白質運輸或儲存。

表1 不同溶劑中PHL-BHb的猝滅常數、結合常數和結合位點數

2.2.3 熱力學和相互作用力 當溫度變化范圍較小時,ΔH可視為常數,故PHL-BHb熱力學參數可采用Van’t Hoff方程計算。

式(3)

ΔG=ΔH-TΔS

式(4)

式(3)中:R為氣體摩爾常數,8.31J/(mol·K);Ka為結合常數。

計算結果見表2。由表2可知,各不同溶劑體系的ΔG<0,說明反應可自發進行;ΔS<0,ΔH<0,說明PHL-BHb相互作用以范德華力和氫鍵為主[27]。

表2 不同溶劑體系中PHL-BHb的熱動力學參數

2.2.4 結合距離 根據Forster偶極-偶極非輻射能量轉移機理及下列關系式

式(5)

式(6)

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ

式(7)

式(5)中,F0為熒光發射強度,F為熒光發射體/熒光受體濃度比為1∶1時的熒光強度;式(6)中,K2、N、φ和J分別表示偶極空間取向因子,介質折射常數,BHb熒光量子產率,供體熒光發射譜與受體吸收譜的重疊積分;式(7)中,F(λ)為BHb在波長λ處的熒光強度,ε(λ)為熒光受體在波長λ處的摩爾吸光系數。在相同條件下測定BHb熒光光譜和PHL的紫外光譜,將兩光譜重疊見圖3(a)、(b)和(c),并利用式(7)計算重疊面積J。

圖3 3種不同溶劑體系中BHb發射光譜與PHL吸收光譜重疊圖

Trp量子產率Φ=0.15,N為1.366,K2為2/3,結果見表3。在dH2O、DMSO、EtOH 3種不同溶劑體系中,BHb與PHL的結合距離r0分別為4.561、4.576、4.566 nm,均小于7 nm,說明PHL與BHb在不同溶劑體系中均發生了非輻射能量轉移[28]。

表3 不同溶劑體系中PHL-BHb的結合距離

2.3 同步熒光光譜

BHb分子中Trp、Tyr和Phe熒光峰存在重疊現象,采用同步熒光光譜法可判斷其微環境和極性變化。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm分別代表Tyr和Trp的熒光光譜[29]。圖4(a)和4(b)、圖5(a)和5(b)、圖6(a)和6(b)分別表示dH2O、10% DMSO和10% EtOH體系在Δλ1=15 nm和Δλ2=60 nm的同步熒光光譜,其熒光發射峰約在307 nm和333 nm左右。由圖4(a)和4(b)、圖5(a)和5(b)、圖6(a)和6(b)可知,隨PHL濃度增加,Tyr和Trp熒光強度均逐漸降低,且代表Trp的熒光強度下降程度大于代表Tyr的熒光強度,表明PHL主要與Trp殘基而非Tyr相互作用[30]。根據Horst[31],同步熒光還可用來判斷蛋白質分子的共軛度,熒光峰紅移,共軛度增加,反之,共軛度降低。隨PHL濃度增加,在dH2O中,Tyr發生輕微紅移,而Trp發生輕微藍移,其它2種溶劑體系無明顯紅/藍移,這表明,在dH2O中,PHL使BHb共軛度受到一定影響而下降,且Trp殘基的微環境更加疏水[32]。

圖4 dH2O中PHL-BHb同步熒光光譜

圖5 10% DMSO中PHL-BHb同步熒光光譜

圖6 10% EtOH中PHL-BHb同步熒光光譜

2.4 紅外光譜

PHL對BHb紅外光譜的影響見圖7。由圖7可知,PHL使BHb酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動和C-N伸縮振動從1541.809 cm-1紅移至1540.363 cm-1,這歸屬于α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的疊加[33],PHL使BHb酰胺I帶的C=O伸縮振動從1657.517 cm-1紅移至1656.071 cm-1,這歸屬于α-螺旋的特征吸收峰[34],這表明PHL與BHb存在相互作用且使BHb分子中C=O、N-H、C-N的存在狀態發生了某種變化,改變了BHb二級結構。另外,PHL使BHb酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶強度均增強,這可能是由于PHL的酚羥基與BHb分子中C=O或C-N基團通過氫鍵作用,使BHb有序性降低而發生某種重排所致[35]。朱穎[36]研究表明,花青素引起大豆分離蛋白的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶發生藍移,而韓敬美[37]研究表明,煙堿使胃蛋白酶的酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶分別發生紅移和藍移,這說明不同種類蛋白質和小分子化合物作用,其引起蛋白二級結構的變化不同。

2.5 3種不同溶劑體系對PHL、BHb、PHL-BHb抗氧化性的影響

在3種不同溶劑體系中,BHb、PHL、PHL-BHb對DPPH和ABTS自由基清除率分別見圖8(a)和8(b)。PHL抗氧化性主要取決酚羥基的供氫或供電子能力[38]。通過測定PHL對DPPH和ABTS自由基清除率的大小,分析加入BHb后不同溶劑體系對PHL氧化性的影響。由圖8(a)可知,當加入BHb后,在dH2O和10%DMSO體系中,PHL對DPPH自由基清除率均顯著增加(P<0.05);在10%DMSO體系中,PHL對DPPH自由基清除率增加顯著(P<0.05);在10%EtOH體系中,PHL對DPPH自由基清除率顯著下降(P<0.05)。由圖8(b)可知,當加入BHb后,在3種不同溶劑體系中,PHL對ABTS自由基清除率均顯著增加(P<0.05)。這表明在不同的抗氧化體系中,BHb對PHL抗氧化性的影響不同。

3 結論

在3種不同溶劑體系中,紫外光譜表明PHL與BHb均存在相互作用,熒光光譜表明PHL對BHb具有熒光猝滅作用,且猝滅機理均為靜態猝滅和非輻射能量轉移,相互作用力以范德華力和氫鍵為主。同步熒光光譜表明,BHL與PHL的相互結合位點更接近BHb的Trp殘基而非Tyr殘基。紅外光譜表明,在dH2O體系中,酰胺Ⅰ和Ⅱ帶發生輕微紅移。對DPPH和ABTS自由基清除率表明,除10%EtOH-DPPH體系外,PHL-BHb均不同程度提高了PHL對DPPH和ABTS自由基的清除率。前人有關小分子化合物與生物大分子的相互作用研究,大多為單一溶劑體系且主要以牛血清白蛋白為模型蛋白,而本實驗在dH2O、10% DMSO和10% EtOH等溶劑體系,研究了PHL與BHb的相互作用及其對PHL抗氧化性的影響,這為拓展水溶性較差的小分子活性化合物與生物大分子的相互作用提供了新視角,但PHL與BHb相互作用的具體結合位點仍有待于通過分子模擬等手段進一步闡明,同時PHL與BHb的相互作用對BHb生物學功能的影響也有待于進一步研究。