基于非水溶性膳食纖維介質的雙歧桿菌生物膜動態培養及其抗逆性研究

陳翠翠,杭 鋒,張 灝,,李元昆,趙建新,陳 衛,陸文偉,,*

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;3.江南大學(揚州)食品生物技術研究所,江蘇揚州 225004;4.新加坡國立大學楊璐齡醫學院微生物學系,肯特區 119077)

雙歧桿菌最早是由法國學者Tissier從母乳喂養嬰兒的糞便中分離出來的一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌。大量研究報道雙歧桿菌具有抗腸道致病菌、調節腸道菌群平衡、抗癌、免疫調節等益生作用[1-2],被廣泛應用于醫療、食品、保健等領域。然而雙歧桿菌由于特殊的生理特性,極易在開發益生菌制劑和儲藏過程中死亡,且經人體胃腸道內胃酸膽鹽的脅迫下,活菌數會驟然下降,限制了其對人體發揮有益的作用。真空冷凍干燥技術是制備高活性菌粉的最有效的一種干燥技術,但凍干過程中仍會使菌體受到多種有害作用力,如凍結應力、低溫應力以及干燥應力等,導致菌體活性下降[3-4];噴霧干燥技術可用于大規模的生產菌粉,但噴干過程中的高溫(100～200 ℃)和干燥脫水,會嚴重損傷細胞。目前大量研究主要集中在如何添加保護劑、優化干燥工藝等方式來提高益生菌的抗逆性[5],對如何提高益生菌自身抗逆性卻報道甚少。

生物膜是由附著在生物或非生物表面的細菌及其自身分泌的細胞外聚合物基質(extracellular polymeric substances,EPS)所形成的具有三維網狀結構的細菌群落[6-7]。研究發現超過99.9%的細菌都附著在不同材料表面的生物膜中生長[8]。生物膜的形成阻止了細菌與有害物質的直接接觸,提高細菌對抗菌藥物的耐藥性[9],據推測,這可能是由于細胞外聚合物基質的保護作用和生物膜細胞特有的群體感應所致[10]。關于生物膜,近年來研究主要集中在如何去除病原菌的生物膜[11],對于如何利用生物膜增強益生菌的抗逆性的研究報道卻很少。張國麗等研究發現植物乳桿菌生物膜形成后對溫度、酸堿、鹽度耐受性均有不同程度的提高[12]。蒲明珠驗證基于椰果表面形成的乳酸菌生物膜相比于游離菌株,在人工胃腸道、高膽鹽環境下的存活率也顯著提高[13],Cheow等驗證形成生物膜后的鼠李糖乳桿菌微膠囊,抗冷凍干燥能力提高了將近40倍[14]。眾多研究表明,利用益生菌生物膜提高其存儲穩定性和抗逆性將在未來的工業化應用上具有廣闊的前景。

生物膜的產生離不開成膜基質,目前報道研究人員常用微孔板作為成膜載體[15],無法實現工業化應用。成膜基質的選擇必須遵循不溶于水,且符合食品添加標準的要求。非水溶性膳食纖維作為一種益生元,表面粗糙,成膜的比表面積大,并且可以大規模地發酵制備,是一種理想的成膜基質。本實驗研究了雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維上形成生物膜的能力,探究了雙歧桿菌最佳成膜時間,比較了生物膜成膜菌株和浮游菌株凍干存活率和對模擬胃腸液的耐受性,以期為益生菌生物膜在未來食品工業領域得到廣泛應用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

雙歧桿菌FJSWX25M1 江南大學食品生物技術中心菌種保藏庫;牛肉膏、胰蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸二氫鉀 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;胃蛋白酶(1∶10000)、胰蛋白酶(1∶250) Singma公司;膽鹽LP0055 Oxoid公司;黃豆粉、小麥纖維、筍干粉、玉米粉、葡萄籽粉、蘋果纖維 興化市潤宇食品有限公司。

EL3002型電子天平、FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LAB DANCER漩渦振蕩器 德國IKA公司;MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋 日本SANYO公司;厭氧工作站 Whitley 公司;ZHJH-C1115B型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司;LYOBETA-5PS凍干機 西班牙Telstar公司;biotech-3000 5 L×3平行發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化和動態生物膜培養 取活化三代后的雙歧桿菌以2%的接菌量接種到裝有50 mL mMRS液體培養基(添加0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯培養基)的錐形瓶中,分別添加和不添加非水溶性膳食纖維(黃豆粉、小麥纖維、筍干粉、玉米粉、葡萄籽粉、蘋果纖維),培養游離菌株和生物膜菌株,載體基質添加量為20 g/L,固定培養基于搖床內,于37 ℃培養48 h,轉速為100 r/min,使載體基質懸浮在培養基中而不沉降,讓菌體充分黏附于基質上形成生物膜。

1.2.2 雙歧桿菌生物膜的發酵罐生產 取活化三代后的雙歧桿菌以5%的接菌量接種到3 L的發酵罐,分別添加和不添加非水溶性膳食纖維(葡萄籽粉和小麥纖維),培養游離菌株和生物膜菌株,載體基質添加量為20 g/L,培養溫度37 ℃,調整發酵罐轉速為100 r/min,剛好使非水溶性膳食纖維顆粒不會沉降下去,充入氮氣使罐內氣壓達到0.1 MPa,分別厭氧培養12、24、36、48 h后取樣計算成膜活菌數和總活菌數。

1.2.3 平板計數法測定成膜活菌數 成膜活菌數計數方法參考Ushakova等試驗方法[16-17],吸取含有載體的發酵培養液1 mL于2 mL EP管中,同一實驗組分成兩份,一份于離心機中以100 r/min的轉速低速離心2 min,倒掉上清液,對麥麩上的活菌數進行平板菌落計數,根據麥麩所占體積計算,結果為成膜活菌數(CFU/mL,濕重);另一份培養液直接在旋渦振蕩器最大轉速攪拌10 min,進行活菌計數,計數結果為總活菌數(CFU/mL)。

1.2.4 雙歧桿菌生物膜的掃描電鏡微觀觀察 取發酵培養液100 r/min低速離心2 min,倒掉上清液,取生物膜載體顆粒,同時以空白載體作為對照,用含 2%(w/v)戊二醛溶液固定,取出樣品后用磷酸緩沖液漂洗2次,依次用50%、70%、90%、100%乙醇溶液逐級梯度脫水,每次脫水時間為15 min。脫水完成后,自然風干30 min,取適量樣品用導電粘膠粘貼在樣品臺,噴鍍金粉,放入掃描電子顯微鏡中觀察[18]。

1.2.5 雙歧桿菌的凍干 凍干前樣品制備:發酵培養同1.2.2實驗方法,培養36 h后提取發酵液,其中未添加載體的發酵液加入同等質量滅菌后的載體,保持發酵液載體量一致,減小保護劑與菌泥比差異。發酵液于離心機8000×g,4 ℃,離心20 min,棄上清,收集菌泥,以1∶2 (w/v)的比例加入滅菌后質量分數為10%脫脂乳保護劑,混勻進行真空冷凍干燥。

凍干工藝為:預凍:預先將層板溫度在1 h內降至-50 ℃,放入樣品,保持4 h;一次干燥階段:抽真空至最低真空度,設定 60 min 升高層板溫度至-30 ℃,保持此溫度恒定30 h;二次干燥階段:快速升溫至 20 ℃,并保持此溫度恒定 20 h[19]。

1.2.6 凍干存活率的測定 凍干前活菌數的測定:在凍干前留樣用于測定凍干前的活菌數。

凍干后活菌數的測定:添加PBS緩沖液還原到凍干前體積,混勻后平板菌落計數[20]。

1.2.7 凍干菌粉模擬胃腸液耐受能力的測定 模擬胃液:將胃蛋白酶溶于滅菌的0.85%(W/V)的生理鹽水中,用1 mol/L濃鹽酸調節pH至3.0,使其濃度達到3 g/L,使用0.22 μm無菌濾膜過濾后使用,現配現用。

模擬腸液:將胰蛋白酶、膽鹽溶于滅菌的0.85%(W/V)的生理鹽水中,使其終濃度分別達到1 g/L和0.3%,用0.1 mol/L的NaOH調節pH至8.0。使用0.22 μm無菌濾膜過濾后使用,現配現用。

取0.1 g菌粉溶于配制好的0.5%生理鹽水平板菌落計數,作為脅迫處理前活菌數;溶于配制好的模擬胃液培養2 h、模擬腸液培養4 h后進行菌落平板計數,作為脅迫處理后活菌數[21-23]。

存活率(%)=脅迫處理前活菌數/脅迫處理后活菌數×100

1.3 數據處理

實驗數據為重復三次所得,以平均值±標準誤差(mean±SD)表示。采用Microsoft Excel 2016和Graphpad Prism 7.0進行數據處理,運用ANOVA進行統計學分析,兩組數據的差異分析采用T檢驗進行判斷,差異顯著表示P<0.05。

2 結果和分析

2.1 雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維成膜情況的比較

為了探究雙歧桿菌在不同基質上(黃豆粉、小麥纖維、筍干粉、玉米粉、葡萄籽粉、蘋果纖維)形成生物膜的能力,通過計算生物膜活菌數和成膜率表征雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維基質上的成膜情況(圖1),并做了相應的掃描電鏡圖(圖2)。結果發現,如圖1所示,在葡萄籽粉上成膜活菌數、成膜率最高,分別為(1.98±0.13)×108CFU/mL和40.56%±2.64%。其次是小麥纖維成膜活菌數為(1.38±0.19)×108CFU/mL,成膜率為36%±3.55%。在玉米粉、筍干粉、黃豆粉表面,生物膜形成能力較差一些,在筍干粉表面,生物膜成膜活菌數最低,成膜能力最差。從圖2電鏡圖更加直觀得看到,在小麥纖維和葡萄籽粉上粘附的生物膜菌株最多,粘附能力最強,而在其他幾種基質表面上并不能很好的成膜,可以得出雙歧桿菌在不同基質上形成生物膜能力并不一致。生物膜的形成需附著在生物或非生物材料表面[24],Grossova等[9]選擇不同的載體如馬鈴薯纖維,海藻酸鈉,燕麥纖維等固相基質發酵益生菌,發現在不同基質上形成生物膜能力并不一致,本實驗結果與其基本一致。圖3為小麥纖維和葡萄籽粉空白載體的電鏡圖,可以看到葡萄籽粉具有多孔狀結構,Kathryn等[25]報道指出,表面粗糙的材料更易于生物膜的粘附。因此得出葡萄籽粉是雙歧桿菌FJSWX25M1最適宜成膜的載體。

圖2 雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維基質上成膜的掃描電鏡圖片

圖3 葡萄籽粉(A)和小麥纖維(B)的掃描電鏡圖片

2.2 發酵時間對雙歧桿菌成膜情況的影響

為了探討雙歧桿菌FJSWX25M1最佳成膜時間,選擇葡萄籽粉和小麥纖維基質作為粘附載體,使用發酵罐發酵培養生物膜,分別在12、24、36、48 h計算雙歧桿菌成膜活菌數以及成膜率。結果發現,菌株在36 h時基于葡萄籽粉基質的成膜率最高為36.68%±2.75%,成膜活菌數為(1.78±0.18)×108CFU/mL;而以小麥纖維為基質形成生物膜時,在24 h成膜率最高為33.39%±0.87%,此時成膜活菌數達到(1.42±0.13)×108CFU/mL。雙歧桿菌因粘附材料的不同,生物膜最佳成膜時間也并不相同。生物膜的形成由于受到微生物和粘附基質的物理化學相互作用以及附著材料的表面性質的影響[26],致使菌株在不同載體最佳成膜時間并不一致。

圖4 不同發酵時間對雙歧桿菌成膜的影響

2.3 生物膜形成對雙歧桿菌凍干存活率的影響

生物膜細菌在不利環境條件下,會通過自身分泌的EPS聚合在固體表面,阻止了細菌與有害物質的直接接觸,提高對惡劣環境的耐受性[9]。為了探究生物膜菌株和浮游菌株凍干耐受性的差異,通過不同發酵時間形成的生物膜菌株跟浮游菌株凍干存活率的比較(如表1),發現以小麥纖維和葡萄籽粉為載體形成的生物膜菌株凍干后的存活率明顯高于浮游菌株,以葡萄籽粉為載體形成的雙歧桿菌生物膜發酵培養36 h后的凍干存活率最高,可達到35.65%±2.26%,浮游菌株凍干存活率僅為5.51%±0.71%,提高了6.5倍(P<0.01)。而以小麥纖維為載體形成的雙歧桿菌生物膜發酵培養24 h后的凍干存活率最高,為29.89%±5.12%,較浮游菌株凍干存活率7.43%±0.73%提高了4倍(P<0.01)。

表1 生物膜菌株和游離菌株凍干存活率的變化

2.4 生物膜形成對雙歧桿菌模擬胃腸液耐受性的影響

比較游離菌株和生物膜菌株對模擬胃腸液耐受性,結果如表2所示,游離菌株的模擬胃液和腸液存活率分別為10.1%±1.48%和1.07%±0.22%,而以葡萄籽粉和小麥纖維為載體形成的生物膜菌粉,其模擬胃液存活率分別提高了5.9倍和5.1倍(P<0.01),存活率達到59.82%±2.32%和51.98%±2.73%,模擬腸液提高了12.6倍和10倍,存活率達到13.53%±1.5%和10.75%±3.29%,由此可見,生物膜狀態下的雙歧桿菌對模擬胃腸液的耐受性顯著增加,Grossova等[9]研究結果表明,形成生物膜后的乳桿菌比游離菌株的耐酸耐膽鹽能力顯著增強,本實驗得出結論與其基本一致。

表2 生物膜菌株和游離菌株模擬胃腸液存活率的變化

3 結論

本實驗通過比較雙歧桿菌在6種非水溶性膳食纖維的成膜情況,得出雙歧桿菌在葡萄籽粉上的成膜能力最強,其次是在小麥纖維上。另外發現基于不同載體的最佳成膜時間并不一致,基于葡萄籽粉最佳成膜時間為36 h,基于小麥纖維最佳成膜時間為24 h。進一步發現,雙歧桿菌形成生物膜后其耐受性顯著提高,凍干存活率提高4～6.5倍(P<0.01),模擬胃液耐受性提高5.1～5.9倍(P<0.01),模擬腸液存活率提高10～12.6倍(P<0.01)。研究結果表明雖然雙歧桿菌在不同非水溶性膳食纖維上形成生物膜能力和成膜時間不同,形成生物膜后其抗逆性均顯著提高,這一研究結果將為開發抗逆性益生菌制劑提供理論基礎。