固態(tài)枯草芽孢桿菌菌劑的制備工藝研究

趙甜宇,潘朝陽,張朝輝,孫建安,*,毛相朝,2

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室,山東青島 266237)

枯草芽孢桿菌是一種能形成內(nèi)生抗逆芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌,適應(yīng)環(huán)境能力強,具有較強的耐酸、耐鹽和耐高溫能力[1-3],且無毒無害,廣泛應(yīng)用于生物保鮮、生物防治、環(huán)境保護、種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、洗滌工業(yè)中[4-9]。枯草芽孢桿菌列于我國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《飼料添加劑品種目錄(2013)》中,可在動物飼料中使用。枯草芽孢桿菌可以抑制有害菌的生長,調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,改善腸道微生態(tài)環(huán)境,提高消化酶活力,促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,提高免疫力[10-11]。同時,枯草芽孢桿菌還是一種植物根際促生菌,可用作生物肥料,能夠提高作物抗性、促進作物生長、改良土壤、改善作物品質(zhì)[12]。固態(tài)枯草芽孢桿菌菌劑作為一種活菌制劑,易于保藏,運輸方便,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,貨架期長,相較于液態(tài)菌劑有其獨特優(yōu)勢,有利于菌劑由實驗室走向?qū)嶋H應(yīng)用[13-15]。

近年來,枯草芽孢桿菌因其無毒無害、抗逆性強等優(yōu)點在飼料、肥料中廣泛應(yīng)用,其可作為抗生素、化學(xué)肥料和農(nóng)藥的替代品[16-17]。但目前國內(nèi)外菌劑的制備過程中,菌株發(fā)酵培養(yǎng)基多采用蛋白胨、酵母粉等,存在成分復(fù)雜、成本較高的缺點,且所采用的干燥技術(shù)多為真空冷凍干燥、噴霧干燥等,真空冷凍干燥適用范圍廣、菌體存活率高,但設(shè)備昂貴,耗時長,操作復(fù)雜[18-19];噴霧干燥技術(shù)操作簡單,易于連續(xù)化生產(chǎn),但熱消耗大,投資成本高,且高溫不利于菌體的存活[20-21]。因此,如何在菌劑制備過程中降低能耗成本、縮短制備周期、提高菌劑存活率,對于枯草芽孢桿菌菌劑的高效制備和推廣應(yīng)用,具有重要的理論價值和實際意義。

本研究利用實驗室篩選的高活性益生菌株BacillussubtilisOKF-004進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng),得到一種可獲得高芽孢數(shù)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件,再通過載體與保護劑保護條件下的鼓風(fēng)干燥,建立一種操作簡單、成本低廉的固態(tài)微生物菌劑制備工藝,制備的菌劑可作為飼料添加劑和微生態(tài)制劑廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè),又可作為土壤生態(tài)制劑應(yīng)用于種植業(yè),為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供了一種可行的菌劑制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 實驗室篩選菌株BacillussubtilisOKF-004;阿根廷紅蝦蝦頭、麩皮、豆粕 青島盛隆偉業(yè)科技有限公司;沸石粉、玉米淀粉 山東優(yōu)索化工科技有限公司;海藻糖、脫脂奶粉、殼聚糖 北京索萊寶科技有限公司;蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司;瓊脂粉 索萊寶科技有限公司;葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、氯化鈉 國藥集團,均為國產(chǎn)分析純。

HFsafe-1200LC(A2)生物安全柜 上海力申科學(xué)儀器有限公司;DK-98-1型恒溫水浴鍋 泰斯儀器有限公司;DXHY-2000恒溫培養(yǎng)搖床 長沙湘儀離心機儀器有限公司;GI80TW高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;Labplant Spray Dryer-SD Basic 嘉盛(香港)科技有限公司;DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海樹立儀器儀表有限公司;DL-7M高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司;5804 R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;ESH105水分測定儀 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;JYL-C020勻漿機 九陽股份有限公司;PL202-S電子天平 Metteler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液制備 取-20 ℃保藏的枯草芽孢桿菌甘油管菌株,以1%的接種量接種到LB培養(yǎng)基,30 ℃,200 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h,獲得種子液。

1.2.2 生長曲線的測定 將種子液按照5%的接種量接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1%玉米淀粉、1%豆粕、1%葡萄糖,自然pH)中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng),每4 h測定一次芽孢數(shù)。

1.2.3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 以1%玉米淀粉、1%豆粕、1%葡萄糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,選取玉米淀粉、豆粕、葡萄糖的添加量為工藝優(yōu)化因素,分別比較不同添加量的玉米淀粉(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、豆粕(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%)、葡萄糖(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)對芽孢數(shù)的影響。將種子液按照5%的接種量接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)28 h,測定芽孢數(shù)。

1.2.3.2 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,確定玉米淀粉、豆粕、葡萄糖添加量三個因素的水平,設(shè)置3因素3水平正交試驗,每組實驗設(shè)置3個平行,測定芽孢數(shù),獲得最佳培養(yǎng)基組分。實驗因素和水平詳見表1。

表1 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗因素水平設(shè)計

1.2.4 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實驗 以優(yōu)化后的發(fā)酵液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,以初始pH自然、裝液量30 mL、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量5%為初始培養(yǎng)條件,選取初始pH、裝液量、培養(yǎng)溫度、接種量為優(yōu)化因素,分別設(shè)置不同初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、裝液量(20、30、40、50、70 mL)、培養(yǎng)溫度(28、30、32、34、37 ℃)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%),200 r/min培養(yǎng)28 h,測定芽孢數(shù)。

1.2.4.2 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,確定初始pH、裝液量、培養(yǎng)溫度、接種量四個因素的水平,設(shè)置4因素3水平正交試驗,測定芽孢數(shù),獲得最佳培養(yǎng)條件。實驗因素和水平詳見表2。

表2 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗因素水平設(shè)計

1.2.5 不同干燥方法的比較 噴霧干燥:根據(jù)參考文獻[22-23]并以預(yù)實驗為依據(jù)確定了噴霧干燥參數(shù)。在優(yōu)化后的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h,分別添加10%的助劑沸石粉、玉米淀粉,設(shè)置進風(fēng)口溫度140 ℃,風(fēng)速50 m3/h,泵速7 mL/min,進行噴霧干燥,測定噴干前后的芽孢數(shù),計算存活率。

鼓風(fēng)干燥:在優(yōu)化后的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h,培養(yǎng)結(jié)束后于4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與生理鹽水以1∶5的比例復(fù)溶制得菌懸液,將載體(沸石粉、玉米淀粉)與菌懸液以1∶2的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測定烘干前后的芽孢數(shù),計算存活率。

1.2.6 鼓風(fēng)干燥制備菌劑的工藝研究

1.2.6.1 載體種類的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與生理鹽水以1∶5的比例復(fù)溶制得菌懸液,將滅菌備用的載體(麩皮、沸石粉、玉米淀粉、阿根廷紅蝦蝦頭粉末)分別與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測定烘干前后的芽孢數(shù),計算存活率。

1.2.6.2 載體與菌懸液混合比例的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與生理鹽水以1∶5的比例復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以不同比例(5∶3、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3)混合均勻,50 ℃烘干6 h,測定烘干前后的芽孢數(shù),計算存活率。

1.2.6.3 保護劑種類的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與不同保護劑(10%的海藻糖、脫脂奶粉、甘油、可溶性淀粉、殼聚糖)以1∶5的比例復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測定烘干前后的芽孢數(shù),計算存活率。

1.2.6.4 保護劑濃度的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與不同濃度(0、5%、10%、15%、20%)的甘油以1∶5的比例復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測定烘干前后的芽孢數(shù),計算存活率。

1.2.6.5 菌泥與保護劑混合比例的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與5%的甘油以不同比例(1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11)復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測定烘干前后的芽孢數(shù),計算存活率。

1.2.6.6 烘干時間對芽孢數(shù)的影響 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與5%的甘油以1∶7的比例復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干,測定不同烘干時間(0、2、4、6、8、10 h)時的芽孢數(shù)、水分含量。

1.2.7 測定方法 芽孢數(shù)測定:液體菌液直接進行測定,固體菌劑參照《農(nóng)用微生物菌劑(GB 20287-2006)》制備成浸提液[24](取2 g固態(tài)樣品加入含有7～10顆玻璃珠的20 mL無菌水,置于200 r/min的恒溫振蕩器中振蕩30 min即獲得浸提液)后進行測定。采用水浴涂平板法[25],將菌液/浸提液置于80 ℃水浴中維持15 min后,吸取100 μL的菌液/浸提液加入到900 μL無菌生理鹽水中,混勻制成1∶10樣品勻液,依次做10倍系列稀釋,分別吸取各稀釋度的100 μL稀釋液注入到平板計數(shù)培養(yǎng)基中,用涂布棒將稀釋液混勻鋪平,倒置,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,選取菌落數(shù)在30～300之間的培養(yǎng)皿計菌落數(shù)。

菌液中芽孢數(shù)(CFU/mL)=(每皿平均菌體數(shù)×該發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)×1000)/100

固體菌劑中芽孢數(shù)(CFU/g)=(每皿平均菌體數(shù)×該浸提液的稀釋倍數(shù)×1000×浸提液體積)/(100×樣品質(zhì)量)

水分含量測定采用水分測定儀進行測定,在水分測定儀將樣品烘干至恒重時直接從水分測定儀上讀數(shù)。

將噴干助劑、烘干載體、干燥后收集所得粉劑進行稱重,并計算干燥過程中的產(chǎn)品得率:

其中,干燥后收集物的質(zhì)量指噴干或烘干后可收集得到樣品的質(zhì)量,干燥前固形物的質(zhì)量是指添加入干燥體系中的助劑或載體的質(zhì)量。

存活率的計算:

在采用鼓風(fēng)干燥方法制備固體菌劑的過程中,需經(jīng)過菌液離心、菌泥復(fù)溶步驟,在離心、復(fù)溶過程中總芽孢數(shù)的保留率即為芽孢的離心回收率。芽孢回收率的計算:

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013處理數(shù)據(jù),采用Origin軟件作圖。每組實驗設(shè)置3個平行,采用SPSS 18.0軟件進行單因素實驗統(tǒng)計學(xué)顯著性分析,采用Minitab 17軟件進行正交試驗設(shè)計及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的測定

如圖1所示,在發(fā)酵前12 h,枯草芽孢桿菌產(chǎn)生芽孢緩慢,芽孢數(shù)均較少,低于1×107CFU/mL,這與徐世榮等[26]提到的37 ℃條件下芽孢的形成需要7 h的論述大致一致,芽孢的形成取決于Spo0A基因的表達,而芽孢的形成相對于基因的表達具有滯后性[27]。隨著發(fā)酵時間的延長、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,芽孢開始迅速形成,12～28 h,芽孢數(shù)快速增加,28 h后又逐漸減少。枯草芽孢桿菌培養(yǎng)28 h,芽孢數(shù)達到2.8×109CFU/mL,為了獲得最大數(shù)量的芽孢,此后的優(yōu)化過程中,采取發(fā)酵28 h收菌,測定芽孢數(shù)。

圖1 枯草芽孢桿菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線

2.2 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗 為了獲得低成本、高效率的產(chǎn)孢培養(yǎng)基,經(jīng)實驗初期探索,選取玉米淀粉、豆粕、葡萄糖作為培養(yǎng)基組分,設(shè)計單因素實驗,確定其添加量。單因素實驗結(jié)果如圖2所示,隨著玉米淀粉、豆粕、葡萄糖含量的增加,芽孢數(shù)均呈先增加后減少的趨勢,說明三種物質(zhì)的濃度過高或過低均不適于芽孢的形成。玉米淀粉含量為2%時,芽孢數(shù)最多(圖2a),與其他添加量相比,芽孢數(shù)無顯著差異(P>0.05)。豆粕添加量的改變對芽孢數(shù)的影響較大,豆粕添加量為3%時,芽孢數(shù)最多,可達到4.4×109CFU/mL(圖2b),且與其他組相比,芽孢數(shù)具有顯著性差異(P<0.05)。多于或少于2.5%的葡萄糖含量均不適合芽孢最大量的形成,葡萄糖含量為2.5%時,芽孢數(shù)量最多(圖2c),與其他添加量相比具有顯著性差異(P<0.05)。綜合考慮,玉米淀粉添加量、豆粕添加量、葡萄糖添加量分別選擇為2%、3%、2.5%。

圖2 玉米淀粉(a)、豆粕(b)、葡萄糖(c)添加量對芽孢數(shù)的影響

2.2.2 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以芽孢數(shù)為指標(biāo),針對玉米淀粉、豆粕、葡萄糖添加量設(shè)計三因素三水平的正交試驗,實驗結(jié)果如表3與表4所示。各因素對枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響大小為A>B>C,即影響枯草芽孢桿菌產(chǎn)孢的因素依次為玉米淀粉>豆粕>葡萄糖。通過分析,培養(yǎng)基最佳方案為A3B2C1,即玉米淀粉2.5%、豆粕3%、葡萄糖2%。經(jīng)過驗證實驗確定,此時芽孢數(shù)達到3.9×109CFU/mL。

表3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果

表4 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的方差分析

2.3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素實驗 培養(yǎng)條件單因素實驗結(jié)果見圖3。培養(yǎng)基初始pH為5.0時,嚴(yán)重抑制芽孢的形成,與中性、堿性培養(yǎng)條件相比,芽孢數(shù)具有極顯著差異(P<0.01),說明過酸條件不利于枯草芽孢桿菌形成芽孢,在中性、堿性條件下,芽孢數(shù)無顯著差異(P>0.05),當(dāng)初始pH為6.0時,芽孢數(shù)最多(圖3a)。裝液量為20、30、40、50 mL時,芽孢數(shù)均具有顯著性差異(P<0.05),裝液量過多不利于產(chǎn)孢,過多的裝液量與正常裝液量相比,可使芽孢數(shù)降低一個數(shù)量級,這可能是因為枯草芽孢桿菌為好氧細(xì)菌,裝液30 mL時,芽孢數(shù)最多(圖3b)。由圖3c可知,培養(yǎng)溫度過高亦抑制芽孢形成,34、37 ℃時與其他溫度條件下的芽孢數(shù)相比均具有極顯著差異(P<0.01),在28～32 ℃較適宜產(chǎn)孢,培養(yǎng)溫度為30 ℃時,芽孢數(shù)量最多。接種量影響菌體生長代謝速率,過高或過低的接種量均不適合芽孢的形成[28],接種8%的菌液時,芽孢數(shù)最多(圖3d)且具有顯著性差異(P<0.05)。綜合考慮,pH、裝液量、溫度、接種量分別選擇為6、30 mL、30 ℃、8%。

圖3 pH(a)、裝液量(b)、溫度(c)、接種量(d)對芽孢數(shù)的影響

2.3.2 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以芽孢數(shù)為指標(biāo),設(shè)計初始pH、裝液量、培養(yǎng)溫度、接種量四個因素的三水平實驗,由實驗結(jié)果表5、表6可知,各因素對枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響大小為A>B>D>C,即影響枯草芽孢桿菌產(chǎn)孢的因素依次為初始pH>裝液量>接種量>溫度。通過分析,培養(yǎng)條件最佳方案為A3B2C3D1,即初始pH為6.5、裝液量30 mL、溫度32 ℃、接種量7%。

表5 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果

表6 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的方差分析

設(shè)計培養(yǎng)條件為初始pH6.5、裝液量30 mL、溫度32 ℃、接種量7%的驗證實驗。經(jīng)過驗證實驗確定,在最優(yōu)培養(yǎng)條件下,芽孢數(shù)可達到1.10×1010CFU/mL,比吳東等[29]研究的用于制備菌劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得生物量7.90×109CFU/mL更高,且培養(yǎng)基組分簡單、價格低廉。

2.4 菌劑制備工藝研究

2.4.1 不同干燥方法的比較 目前常用的干燥技術(shù)有真空冷凍干燥、噴霧干燥、鼓風(fēng)干燥、微波真空干燥等。由于真空冷凍干燥、微波真空干燥的時間成本、運行成本較高[25],不適合商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),本實驗選取噴霧干燥、鼓風(fēng)干燥兩種干燥方式進行比較,實驗結(jié)果如表7所示。菌液噴霧干燥后,所得菌劑所含芽孢數(shù)較多,沸石粉為助劑進行噴干,產(chǎn)品中芽孢數(shù)為8.8×109CFU/g,以玉米淀粉為助劑進行噴霧干燥,芽孢數(shù)可達到1010CFU/g,且得率較沸石粉高,但也僅為34.33%。鼓風(fēng)干燥實驗,以沸石粉為載體進行烘干所得菌劑的芽孢數(shù)較玉米淀粉為載體的高,為4.5×109CFU/g,且鼓風(fēng)干燥得率較高,固形物基本無損失。考慮到噴霧干燥的熱能、電能消耗較高,且得率較低,接下來針對鼓風(fēng)干燥進一步進行優(yōu)化。

表7 不同干燥方法制備菌劑

2.4.2 鼓風(fēng)干燥制備菌劑的工藝研究

2.4.2.1 載體種類的確定 選取合適的基質(zhì)作為吸附菌液的載體,才能夠保證菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量和使用效果[25,30]。本實驗選取沸石粉、玉米淀粉、麩皮粉末、蝦頭粉末作為干燥載體,從圖4可以看出,蝦頭粉末作為烘干載體時,較其他載體的存活率高,且超過100%,這可能是因為在烘干過程中原本的營養(yǎng)細(xì)胞因環(huán)境變得惡劣而休眠,形成了芽孢,也可能是蝦頭作為一種營養(yǎng)物質(zhì),有利于菌體在溫度不高的烘干過程中再次增殖。蝦類廢棄物含有甲殼素、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、鈣鹽等有價值的化合物,然而大多蝦副產(chǎn)物卻未能利用[31]。蝦類廢棄物日益增加,造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題和經(jīng)濟問題,因此,若能將其作為微生物菌劑載體進行高值化利用,具有重要意義[32]。由于本研究的目的是獲得成本低廉且含高芽孢數(shù)的菌劑,因此,本實驗選取蝦頭粉末作為載體,進行進一步的實驗,同時可實現(xiàn)蝦頭的高值化利用。

圖4 載體種類對菌體存活率的影響

2.4.2.2 載體與菌懸液混合比例的確定 將載體與菌懸液以不同的配比進行混合,找到最適配比以取得最高的存活率。由圖5可知,隨著載體添加量的減少,存活率呈先升高后降低的趨勢。在一定范圍內(nèi),菌懸液添加量的增多引起菌體與載體結(jié)合的增多,存活率增大,當(dāng)載體與菌懸液以2∶3的比例混合時,存活率最高。當(dāng)菌懸液添加量增大到一定程度,載體過飽和,菌體無法與之結(jié)合,使得存活率降低,載體與菌懸液以1∶3的比例混合時,可觀察到有少許菌液無法吸附。因此,載體與菌懸液比例選擇為2∶3 g/mL。

圖5 載體與菌懸液混合比例對菌體存活率的影響

2.4.2.3 保護劑種類的確定 在干燥過程中,細(xì)胞因脫水引起滲透壓增高、細(xì)胞萎縮、蛋白質(zhì)變性從而導(dǎo)致菌體死亡[33]。如圖6所示,添加海藻糖、脫脂奶粉、甘油作為保護劑,相對于直接用生理鹽水復(fù)溶的菌體存活率高,以甘油為保護劑,存活率最高。甘油作為一種滲透性保護劑[34],能夠進入細(xì)胞,維持其滲透壓,同時其帶有的羥基能夠取代水分子與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)形成氫鍵,維持、保護蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[35-36]。可溶性淀粉、殼聚糖作為保護劑時,存活率低于生理鹽水復(fù)溶的菌懸液,可能是因為殼聚糖滅菌后的溶解性較差,未能完全發(fā)揮作用造成的,而可溶性淀粉滅菌冷卻后呈凝膠狀,不利于操作的進行。因此,保護劑選擇為甘油。

圖6 保護劑種類對菌體存活率的影響

2.4.2.4 保護劑濃度的確定 如圖7所示,甘油的加入可以提高菌體存活率,甘油濃度為5%時,存活率最高,隨著甘油濃度的增大,存活率開始降低,這可能與滲透壓升高有關(guān),且20%的甘油由于濃度過高,添加后使產(chǎn)品變得粘膩。因此,保護劑濃度選擇為5%。

圖7 保護劑濃度對菌體存活率的影響

2.4.2.5 菌泥與保護劑混合比例的確定 由圖8可知,在一定范圍內(nèi),菌泥與保護劑的比例比值越小,即保護劑的添加量越多,存活率越高,因為保護劑添加量不足會使得大量菌體因裸露而得不到保護,影響存活率。菌泥與甘油的質(zhì)量/體積混合比例為1∶7時,存活率最高,隨著比值繼續(xù)減小,存活率降低。這可能是因為菌泥與保護劑的混合比例不同引起的菌體周圍保護劑濃度的變化,過高的濃度會影響枯草芽孢桿菌細(xì)胞的滲透壓和通透性,從而導(dǎo)致存活率不高[28,36]。因此,菌泥與保護劑混合比例選擇為1∶7 g/mL。

圖8 菌泥與保護劑混合比例對菌體存活率的影響

2.4.2.6 烘干時間對芽孢數(shù)的影響 如圖9所示,隨著烘干時間的增加,固態(tài)發(fā)酵樣品的水分含量逐漸降低,并在6 h后基本穩(wěn)定。隨著烘干時間的延長、水分含量的降低,單位質(zhì)量中的干物質(zhì)增加,則單位質(zhì)量中的活菌數(shù)隨之增加,并在6 h后,活菌數(shù)趨于穩(wěn)定,考慮到時間成本,可選擇烘干時間6 h作為制備菌劑的最佳時間。

圖9 烘干時間對芽孢數(shù)、菌劑水分含量的影響

2.4.2.7 菌劑制備過程 通過優(yōu)化實驗確定了菌劑制備工藝后,對菌劑制備過程進行了整理,如表8所示,以便對制備工藝整體把握,明確各步驟指標(biāo),有利于進一步的實驗研究。本研究中的離心、復(fù)溶步驟芽孢回收率僅54.65%,與嚴(yán)美婷[26]提到的93.07%的納豆菌活菌回收率相比較低,今后的研究可針對離心步驟進行優(yōu)化,以減小離心過程帶來的損失。本研究通過鼓風(fēng)干燥所得固體菌劑芽孢數(shù)為4.8×109CFU/g,雖然與周亮成等[37]研究的枯草芽孢桿菌BSF01菌劑、王群[38]研究的菌劑相比芽孢數(shù)不算高,但以蝦頭粉末作為載體營養(yǎng)多、價格低,有利于蝦頭的高值化利用。

表8 菌劑制備過程

3 討論與結(jié)論

本文通過單因素實驗和正交試驗,探究了液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的最適形成芽孢的培養(yǎng)基組分與培養(yǎng)條件,優(yōu)化結(jié)果表明,采用2.5%玉米淀粉、3%豆粕、2%葡萄糖的培養(yǎng)基,在初始pH為6.5、裝液量30 mL、溫度32 ℃、接種量7%的條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌時,最適合形成芽孢,芽孢數(shù)最高可達到1.1×1010CFU/mL。另外,本文經(jīng)過對噴霧干燥與鼓風(fēng)干燥兩種制備固態(tài)微生物菌劑方法的比較,研究了通過鼓風(fēng)干燥方法制備菌劑的工藝流程,結(jié)果表明,將菌泥與濃度5%的保護劑甘油以1∶7 g/mL的比例復(fù)溶后制成菌懸液,以蝦頭作為烘干載體,將載體與菌懸液以2∶3 g/mL的比例混合后,于50 ℃烘干6 h,所得菌劑存活率最好,可達140.91%。液態(tài)發(fā)酵菌液含枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)為(0.8～1.1)×1010CFU/mL,根據(jù)原料市購價格計算,得到液態(tài)發(fā)酵菌液原料成本為0.2元/L;本菌劑產(chǎn)品為紅棕色粉末狀物質(zhì),枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)為(3.2～6.3)×109CFU/g,非微生物成分為蝦頭和甘油,根據(jù)原料市購價格可知,得到固態(tài)菌劑成品的原料成本為2.2元/kg。與陳晶等[39]研究的B8干粉菌劑0.19元/g,賈濤等[3]提到的復(fù)合型微生態(tài)產(chǎn)品價格30元/kg相比,本研究制備的菌劑具有一定價格優(yōu)勢。本文研究的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單、價格低廉、發(fā)酵周期短、培養(yǎng)芽孢數(shù)量高,固態(tài)微生物菌劑的制備方法簡便、易于操作、成本低廉,適合工業(yè)化生產(chǎn),且其原料豆粕、玉米淀粉、蝦頭等物質(zhì)綠色且易于獲取,本工藝可將其高值化,應(yīng)用于飼料添加劑、生物肥料當(dāng)中,具有實際意義。