蒲公英黃酮的提取工藝優化及主要成分淺析

徐樹來,王 麗,任紅波,欒雪艷,陳井權

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076;2.黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076;3.哈爾濱商業大學后勤總公司,黑龍江哈爾濱 150076;4.黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所,黑龍江哈爾濱 150086;5.海倫野泰食品加工有限公司,黑龍江綏化 152000)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand Mazz)是一種藥食同源草本植物,富含多種功能性成分,具有較高的食用及藥用價值[1]。蒲公英對多種細菌、真菌、病原體等致病微生物具有抑制作用[2-3]、具有抗螨蟲等有益的生物活性功能[4]。其中黃酮類化合物是其最具代表性的活性物質,具有抑制多種細菌、真菌、病原體等致病微生物[5],具有擴張血管、降糖降脂等作用[6],還具有抗癌活性等多種生物活性[7],有較高的實用開發價值[8]。資料表明:蒲公英在我國分布廣,花期長[9],資源豐富且廉價易得,是良好的黃酮提取原料。因此,研究蒲公英黃酮的提取具有一定的現實意義。

盡管國內外學者對黃酮提取的研究報道較多,Sed對紅千層中黃酮的提取進行了研究[10],李玲娜研究了超聲波復合酶法提取蒲公英根總黃酮工藝[4]。但對蒲公英黃酮提取方面的研究相對較少,而有限的研究也多為復合提取方法,具有工藝復雜、成本高,不適合工業化生產等不足。故有必要對其進行更加深入的研究及優化。

本文對超聲波及微波輔助法提取蒲公英黃酮工藝進行了研究,利用單因素實驗及正交試驗優化提取條件,并通過試驗結果對比分析及黃酮粗提物主要成分的HPLC初步測定,確定并驗證了蒲公英黃酮的最佳提取工藝，以期為蒲公英的深加工及綜合利用提供有益支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒲公英(藥用級) 寶豐醫藥通達店;蘆丁標準品(純度98%) 合肥博美生物科技有限責任公司;無水乙醇(分析純) 天津市富宇精細化工有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純) 天津市天力化學試劑有限公司;無水甲醇(色譜純) 美國Fisher公司;磷酸(色譜純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;乙腈(色譜純) 國藥集團化學試劑沈陽有限公司。

FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平 上海舜宇平衡學儀器有限公司;FA2004A分析天平 上海精天電子儀器有限公司;SP-722E型可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司;KQ-500DE型數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;SHB--Ⅲ循環式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;布氏漏斗、500 mL抽濾瓶 蜀牛玻璃儀器有限公司;XH-MC-1實驗室微波合成儀 北京祥鵠科技發展有限公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮提取工藝及得率測定 精確稱取過60目篩的蒲公英干粉1.000 g,在一定濃度的乙醇溶液、料液比、提取時間和提取溫度的條件下進行超聲處理或者微波處理,抽濾,得提取液。取5 mL提取液至25 mL比色管中,分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min后,再分別加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min后,再分別加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL,再用濃度為60%的乙醇溶液定容至25 mL刻度線,搖勻,放置20 min后,在510 nm的波長處測定吸光度,計算出黃酮得率。

蒲公英黃酮得率計算方法為[11]:

式中:X:黃酮得率(%);C:黃酮提取液濃度(μg·mL-1);V:提取液體積(m)L;N:提取液稀釋倍數;M:稱取蒲公英干粉的質量(g)。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制 采用文獻方法[12],通過標準曲線得到方程:A=0.0092C+0.0035,R2=0.9994,據此計算蒲公英黃酮的得率。

1.2.3 超聲波輔助提取法

1.2.3.1 單因素實驗設計 按照1.2.1的試驗步驟,根據預試驗,設定各單因素固定水平分別為:乙醇濃度60%;料液比1∶20 g/mL;超聲時間30 min;超聲溫度50 ℃;超聲功率300 W。分別考察各單因素不同水平對蒲公英黃酮得率的影響。各因素水平分別設置為:乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%);料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100 g/mL);超聲時間(10、20、30、40、50 min);超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)。

1.2.3.2 正交試驗設計優化超聲輔助提取條件 根據單因素實驗所得最優的工藝提取條件范圍,選擇乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲溫度為因素,進行L9(34)正交試驗,因素與水平編碼如表1所示:

表1 正交試驗因素與水平編碼表

按照正交試驗所得的最優方案做驗證性試驗,平行三次,取平均值,得出最優工藝條件下超聲提取的蒲公英黃酮得率。

1.2.4 微波輔助提取法

1.2.4.1 單因素實驗設計 按照1.2.1的試驗步驟,根據預試驗結果,設定各單因素固定水平分別為:乙醇濃度60%;料液比1∶30 g/mL;微波時間10 min;微波溫度50 ℃;微波功率800 W。分別考察各單因素不同水平對蒲公英黃酮得率的影響。各因素水平分別設置為:乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%);料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100 g/mL);微波溫度(40、50、60、70、80 ℃);微波時間(3、5、10、15、20 min);微波功率(500、600、700、800、900 W)。

1.2.4.2 正交試驗設計優化微波輔助提取條件 根據單因素實驗所得最優的工藝提取條件,選擇乙醇濃度、料液比、微波時間、微波溫度及微波功率為因素,進行 L16(45)正交試驗,因素與水平編碼如表2所示:

表2 正交試驗因素與水平編碼

按照正交試驗所得的最優方案做驗證性試驗,平行三次,取平均值,得出最優工藝條件下微波提取的蒲公英黃酮得率。

1.2.5 蒲公英黃酮的HPLC分析 準確稱取蘆丁0.01 g,用甲醇分別定容于10 mL容量瓶中,0.45 μm濾膜過濾備用,配制不同濃度梯度甲醇稀釋溶液及混合溶液,放入高效液相色譜儀中,得出圖譜[13]。以物質的質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,分別繪制標準曲線,得到線性回歸方程。用最優試驗參數組合制備的蒲公英黃酮提取液,蒸發后干燥至恒重得到粗提物,精密稱取0.05 g,甲醇溶解后定容10 mL,0.45 μm濾膜過濾備用。

上述備用液均在以下高效液相色譜條件下測定:色譜柱:依利特Sinachrom ODS BP(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸(3∶7);流速:1.0 mL/min;運行時間:25 min;柱溫:30 ℃;檢測波長:368 nm;進樣量:10 μL。

測定3次重復完成后,分析樣品色譜圖,并結合線性回歸方程,計算粗提物中蘆丁質量分數。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次,采用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助提取工藝優化

2.1.1 單因素實驗

2.1.1.1 乙醇濃度對蒲公英黃酮得率的影響 由圖1a可知,乙醇濃度由40%增加至60%時,黃酮得率不斷增加,當乙醇濃度達到60%左右時,黃酮類化合物的得率基本達到最高;之后隨著乙醇濃度的增加,其得率緩慢下降。不同乙醇濃度下,蒲公英提取液中黃酮類化合物的得率有明顯差異,乙醇濃度超過70%后,提取液的顏色呈現綠色。原因可能是乙醇濃度小時,蒲公英黃酮不能完全溶解到溶液中,所以黃酮得率較低;而乙醇濃度增高,使一些醇溶性雜質、色素等其他成分溶出量增加,這些成分與黃酮類化合物競爭與乙醇分子結合,從而導致黃酮類化合物的得率下降[14]。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響顯著(P<0.05),綜合分析,適宜的乙醇濃度范圍為55%～65%。

2.1.1.2 料液比對蒲公英黃酮得率的影響 由圖1b 可知,隨料液比的增加,黃酮得率增加,但溶劑用量達到一定程度時,黃酮接近全部溶出,再增加溶劑用量,黃酮的得率下降。當料液比為1∶80 g/mL左右時,黃酮得率基本達到最大值。原因可能是當料液比太小時,蒲公英黃酮與乙醇的接觸面小,蒲公英黃酮不能完全溶解到溶液中,所以得率較低;隨著料液比增大,黃酮與溶劑的接觸面積增大,溶解度增加,得率增加[15]。但當料液比過高時,基本達到飽和狀態,不利于得率提高,而且,料液比過高,增加了分離純化時間及成本。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響極顯著(P<0.01)。綜合分析,選取適宜的料液比范圍為1∶75～1∶85 g/mL。

2.1.1.3 超聲時間對蒲公英黃酮得率的影響 由圖1c可知,隨著超聲時間的延長,黃酮得率逐漸增加,30 min左右達到最高;30 min后,黃酮得率逐漸減少。其原因可能是,超聲時間短,黃酮不能完全溶解出來,所以得率較低,隨著超聲時間的增加,超聲波作用增強,促進了對細胞的破壞作用,黃酮全部溶解出來,得率增加。而超聲時間過長,可能破壞了蒲公英黃酮的結構而使其分解,最后得率降低[16]。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響極顯著(P<0.01)。綜合分析,適宜的提取時間范圍為25～35 min。

2.1.1.4 超聲溫度對蒲公英黃酮得率的影響 由圖1d可知,隨著超聲溫度的升高,黃酮得率先增后減,60 ℃達最大值;此后,黃酮的得率下降,特別是溫度達到80 ℃時,下降幅度較大。原因可能是,溫度過高時,造成部分黃酮類化合物的結構被破壞,所以黃酮得率降低[17-18]。而且乙醇的沸點約為78.3 ℃,當超聲溫度達到80 ℃時,高于乙醇的沸點,乙醇會大量揮發,提高了回流收集成本。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響顯著(P<0.05)。綜合考慮成本及能耗,選取適宜的提取溫度范圍為55～65 ℃。

圖1 各因素對蒲公英黃酮得率的影響

2.1.2 正交試驗結果分析 由表3可知,超聲波輔助提取法中,對黃酮得率的影響因素的主次順序是A>B>D>C,即乙醇濃度>料液比>超聲溫度>超聲時間,最優方案是A2B2C3D2,即乙醇濃度60%、料液比1∶80 g/mL、超聲時間35 min、超聲溫度60 ℃。

表3 正交試驗結果及分析

按照正交試驗所得的最優方案A2B2C3D2,即乙醇濃度60%、料液比1∶80 g/mL、超聲時間35 min、超聲溫度60 ℃的提取條件下,做驗證性試驗,平行三次,取平均值。獲得最優工藝條件下提取的蒲公英黃酮得率為3.97%。

2.2 微波輔助提取工藝優化

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 乙醇濃度對蒲公英黃酮得率的影響 由圖2a可知,黃酮得率隨著乙醇濃度的提高先增加后減小,當乙醇濃度為60%時,黃酮得率最大,之后隨著乙醇濃度的增加,黃酮得率緩慢下降。不同乙醇濃度下,蒲公英提取液中黃酮類化合物的得率有明顯差異,乙醇濃度超過70%后,提取液的顏色呈現綠色。原因可能是乙醇濃度增高后,使一些醇溶性雜質和色素親脂性等成分溶出量增加[19],這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇水分子結合,從而導致黃酮類化合物的得率下降。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響顯著(P<0.05)。綜合分析,選取較優的乙醇濃度范圍為50%～70%。

2.2.1.2 料液比對蒲公英黃酮得率的影響 由圖2b可知,隨溶劑用量的增加,黃酮得率增加,當料液比達到1∶80 g/mL時,黃酮得率最高,黃酮接近全部溶出,再增加溶劑用量,黃酮的得率下降。原因可能是當料液比太小時,蒲公英黃酮與乙醇的接觸面小,蒲公英黃酮不能完全溶解到溶液中,所以得率較低,隨著料液比增大,黃酮與溶劑的接觸面積增大,溶解度增加,得率增加;但是料液比過大時,溶解到溶液中的黃酮濃度被稀釋,得率反而降低[20],而且,料液比過高,增加了分離純化成本。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響極顯著(P<0.01)。綜合成本及提取效果,選取較優的提取料液比范圍為1∶70～1∶90 g/mL。

2.2.1.3 微波溫度對蒲公英黃酮得率的影響 由圖2c可知,蒲公英黃酮得率隨著微波溫度的升高先增加后降低,當微波提取溫度為60 ℃時,黃酮得率達到最大值,溫度繼續上升時,黃酮得率反而下降。原因可能是,微波溫度升高,造成部分黃酮類化合物的結構被破壞,所以黃酮得率降低[21]。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響極顯著(P<0.01)。綜合分析,選取較優的微波提取溫度范圍為50～70 ℃。

圖2 各因素對蒲公英黃酮得率的影響

2.2.1.4 微波時間對蒲公英黃酮得率的影響 由圖2d可知,黃酮得率隨微波時間的增加而逐漸增加,當微波時間為10 min 時,黃酮得率達到最大值,此后隨著微波時間的增加而降低。微波時間過長會使溫度過高,反而會破壞蒲公英中黃酮組分導致得率降低,且影響提取效率;而微波時間過短則無法使蒲公英中的黃酮充分溶出,造成提取不完全[22]。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響極顯著(P<0.01),綜合提取效果及效率,選取較優的黃酮微波時間范圍為5～15 min。

2.2.1.5 微波功率對蒲公英黃酮得率的影響 由圖2e可知,隨著微波功率的增加,黃酮的得率也逐漸增加,當微波功率增加到800 W時,黃酮的得率達到最大值,此后隨著微波功率的增加,黃酮的得率逐漸降低。在一定的微波作用時間內,微波功率越大,物質吸收的能量越多,溫度升高加快,分子運動速度加快,物質的滲透、擴散和溶解速度加快,促進黃酮類物質向溶劑遷移,黃酮得率明顯提高。但是,當微波功率過高時,黃酮得率反而隨著微波功率的增大而逐漸降低。原因可能是,功率過大,溶劑升溫太快,溫度過高,溶劑的揮發性加快,從而造成溶劑損失,而且黃酮類活性成分也易被破壞[23],而得率降低。由單因素方差分析可知,該因素對黃酮提取得率影響極顯著(P<0.01),綜合考慮能耗及提取效果,選取較優的微波功率范圍為700～900 W。

2.2.2 正交試驗結果分析 按照正交試驗所得的最優方案A3B3C3D2E3,即乙醇濃度60%、料液比1∶80 g/mL、微波時間10 min、微波溫度55 ℃、微波功率800 W。在最優提取條件下,做驗證性試驗,平行三次,取平均值,得到最優提取工藝條件下的蒲公英黃酮得率為4.57%。

表4 正交試驗結果及分析

2.3 兩種提取方法的對比分析

由上述2.2和2.3的試驗結果的對比分析可以看出,微波輔助法提取蒲公英黃酮優于超聲波輔助提取方法。原因是兩種提取方法的原理不同:超聲波輔助提取法是運用超聲波產生高速、強烈的空化效應和攪拌作用,振動產生強大的能量,導致植物細胞壁被破壞,加速有效成分的迅速釋放、溶解,從而達到高效提取的效果[24-25]。而微波輔助提取法是利用不同結構物質對波長吸收的差異,使得不同物質被選擇性加熱,而達到從系統中分離出來的效果。微波提取主要是利用其熱效應[26]。上述原理分析表明:超聲波輔助提取是外部振動產生能量,利用的是機械能破壞植物細胞壁,是由內及外的機械作用過程;而微波輔助提取是內部不同物質對波長的吸收,被選擇性加熱,利用的是熱效應,從而達到破壞植物細胞壁,是內部及外部同時進行的偶極子熱運動過程[27]。鑒于上述兩種方法作用原理的不同,微波輔助提取的效果比超聲波輔助提取的效果更好,得率更高。

此外,與超聲波輔助提取法相比,微波輔助提取法具有操作時間短、效率高、溶劑消耗量少、不產生噪音、適于熱不穩定物質等優點[27],且通過本試驗驗證具有較高的蒲公英黃酮得率。表明微波輔助提取蒲公英黃酮是一種快速、有效、得率較高的方法,且便于實現工業化生產,對實際生產具有一定的指導意義。

2.4 蒲公英黃酮的HPLC結果分析

根據蘆丁標準溶液HPLC圖譜(如圖3所示)可知,蘆丁出峰時間約為1.9 min。根據不同質量濃度的HPLC圖譜及定量結果,以樣品的質量濃度為橫坐標,以對應的峰面積為縱坐標,繪制出蘆丁的質量濃度與峰面積的標準曲線,如圖4所示。

圖3 蘆丁標準溶液HPLC圖譜

由圖4蘆丁HPLC標準曲線,經過回歸處理,得回歸方程為:Y=10709X+3.2397,R2=0.9988。

圖4 蘆丁標準溶液HPLC圖譜分析標準曲線

由圖5黃酮粗提物樣品的HPLC圖譜及定量結果可知:樣品中含有蘆丁,峰面積為:683271,濃度為:63.803 μg/mL,質量分數為:12.76%。

圖5 黃酮粗提物樣品HPLC圖譜及定量結果

由圖5黃酮樣品的HPLC圖譜觀察可知,蒲公英黃酮粗提物中,含有較多的蘆丁。而在蘆丁的色譜峰出現之前,在時間約為1.2～1.9 min處,出現了一個僅次于蘆丁的色譜峰,這有可能是一種含量僅次于蘆丁的黃酮單體,需進一步研究確定。

3 結論

本試驗對超聲波輔助提取和微波輔助提取的工藝進行了優化試驗研究,通過單因素實驗和正交試驗,確定了蒲公英黃酮的最優提取工藝條件為:超聲波輔助提取:乙醇濃度60%,料液比1∶80 g/mL,提取時間35 min,提取溫度60 ℃,在此條件下,蒲公英黃酮的得率為3.97%;微波輔助提取:乙醇濃度60%,料液比1∶80 g/mL,提取時間10 min,提取溫度55 ℃,微波功率800 W,在此條件下,蒲公英黃酮得率為4.57%。通過試驗結果對比分析,并結合兩種方法提取機理分析,最終確定微波輔助法提取蒲公英黃酮為較優的提取方法。高效液相色譜(HPLC)法測定結果表明,蒲公英黃酮粗提物中含有蘆丁,質量分數為:12.76%。而蒲公英黃酮中還有一種未知的黃酮類化合物,含量僅次于蘆丁,此種黃酮單體有待進一步研究確定。本研究為蒲公英的深加工及綜合利用提供了有益的探究及參考。