正交試驗優化香菇粉中麥角甾醇和VD2超聲波微波協同提取工藝

胡代花,劉騰美,陳 旺,馮自立

(陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西省資源生物重點實驗室,維生素D生理與應用研究所,陜西漢中 723000)

維生素D2(VD2)作為維生素D(VD)家族的重要成員,能調節人體鈣磷的代謝,促進骨骼的健康。人體VD的缺乏不僅會引起兒童佝僂病、成人的骨質疏松及骨軟化癥,還與腫瘤、高血壓、糖尿病等多發疾病有關[1-2]。由于膳食習慣及生活方式的影響,VD缺乏已成為世界范圍內的健康問題并呈現逐年上升的趨勢[3]。人體自身不能合成VD2,需要通過食物補充。食用菌具有豐富的營養價值,并能調節人體生理功能而頗受青睞。食用菌中VD2含量較低,但卻富含VD2前體-麥角甾醇,通過紫外照射可大幅提高其VD2含量,因此可作為補充VD的重要天然食物來源[4-6]。

目前食用菌中麥角甾醇和(或)VD2提取方法主要有回流提取法[7-9]、超聲波輔助提取法[10-13]、閃式提取法[14-15]、超臨界CO2萃取法[16-17]和微波輔助提取[18]等方法,但現有方法不同程度具有操作費時、步驟繁瑣、生產成本高、安全系數小、不適于批量樣品處理和大規模應用等局限性。進一步探索和開發高效、準確、簡便的同時測定食用菌中麥角甾醇和VD2含量的方法,具有重要現實意義。超聲波-微波協同技術[19-21]一方面利用微波場的熱效應及生物效應加速物質的擴散與溶解,同時超聲波的空化作用對細胞壁產生機械修剪力,使細胞壁破裂,并促進溶劑和活性成分的雙向轉移[22],因此具有效率高、能耗低、不破壞有效成分等優點,近幾年在天然產物中各類生物活性物質提取方面得到了廣泛應用[23-25]。

本文采用超聲波-微波協同提取的方法,以紫外照射后的香菇粉為材料,通過單因素和正交試驗對香菇中麥角甾醇和VD2的提取工藝進行優化,為其科學研究和產品開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菇粉 新鮮香菇(購自漢中市過街樓蔬菜批發市場)剪去根部約1 cm,切成約2 mm厚的薄片,置于電熱鼓風干燥箱內烘干,粉碎,過40 目篩,裝袋密封4度冷藏備用;紫外轉化后香菇粉 稱取香菇粉200 g于燒杯中,加入無水乙醇1200 mL,所得混懸液在磁力攪拌作用下,采用UV-C紫外照射,照射距離50 cm,照射1 h后,減壓蒸除溶劑,置于烘箱中干燥至恒重,裝密封袋4 ℃保存備用;麥角甾醇標準品(純度95.5%)、VD2標準品(純度99.6%) 西安美侖生物技術有限公司;無水乙醇、正庚烷、石油醚(60～90 ℃)、氫氧化鉀 均為分析純,天津市富宇精細化工有限公司;乙醇、乙腈、甲酸 均為色譜級,阿拉丁試劑(上海)有限公司;KOH-EtOH溶液 EtOH∶KOH=4∶1 (V/V),其中KOH溶液濃度為4 mol/L。

XO-SM 100超聲波微波協同反應工作站 南京先歐生物科技有限公司;1260高效液相色譜儀 Agilent科技(中國)有限公司;快速提高維生素D的紫外光照射裝置 實驗室研制(專利號ZL2013204910613);KQ-500E超聲波清洗儀(功率500 W,頻率40 KHz) 昆山舒美超聲儀器有限公司;BSA224S-CW電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 稱取干燥香菇粉200.00 g于燒杯中,加入無水乙醇1200 mL,所得混懸液在磁力攪拌作用下,采用UV-C紫外照射,照射距離50 cm,照射1 h后,減壓蒸除溶劑,置于烘箱中干燥至恒重,裝密封袋4 ℃保存備用[11]。

1.2.2 麥角甾醇和VD2提取的工藝流程 稱取紫外轉化后的香菇粉2.00 g,按1∶20 (g/mL)料液比加入40 mL無水乙醇,混懸液置于超聲波微波協同反應工作站中,室溫條件下,在一定的超聲波和微波功率下提取一定時間后,離心10 min(3500 r/min),上清液乙醇定容至40 mL。0.45 μm微孔濾膜過濾提取液,直接進色譜系統分析[11]。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取時間 稱取紫外轉化后的香菇粉2.00 g,按1∶20 (g/mL)料液比加入40 mL無水乙醇,在超聲波微波協同反應工作站中,室溫條件下,固定超聲波功率為400 W,微波功率為400 W,分別提取5、10、20和40 min后,離心10 min(3500 r/min),上清液乙醇定容至40 mL。0.45 μm微孔濾膜過濾提取液,直接進色譜系統分析?？疾觳煌崛r間對麥角甾醇和VD2提取效果的影響。每處理3個重復。

1.2.3.2 超聲波功率 固定提取時間為20 min,微波功率為400 W,超聲波功率分別為100、200、400和800 W。樣品含量測定方法同1.2.3.1?？疾觳煌暡üβ蕦溄晴薮己蚔D2提取效果的影響,每處理3個重復。

1.2.3.3 微波功率 固定提取時間為20 min,超聲波功率為200 W,微波功率分別為50、100、200、400和800 W。樣品含量測定方法同1.2.3.1。考察不同微波功率對麥角甾醇和VD2提取率的影響,每處理3個重復。

1.2.4 正交試驗 根據單因素實驗結果,選取提取時間、超聲波功率和微波功率作為影響香菇粉麥角甾醇和VD2提取效果的三個因素,分別選取三個水平進行正交試驗,實驗設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平表

1.2.5 HPLC含量檢測方法

1.2.5.1 標準曲線的繪制 配制系列麥角甾醇和VD2標準溶液,0.45 μm微孔濾膜過濾后分別進樣10 μL,于264 nm處測定吸收峰面積,擬合濃度-峰面積曲線。

1.2.5.2 色譜條件 色譜柱為Agilent RP C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm),柱溫為30 ℃,流速1.0 mL/min,進樣量10 μL。流動相為乙腈和0.1%甲酸水溶液95∶5 (V/V)混合,檢測波長264 nm。

1.2.6 含量測定方法學考察

1.2.6.1 系統適用性實驗 麥角甾醇和VD2標準品溶液和樣品溶液均進樣10 μL,利用液相色譜儀測定,記錄色譜圖。

1.2.6.2 線性與范圍考察 系列麥角甾醇和VD2標準品溶液分別進樣10 μL,以264 nm處的吸收峰面積對濃度擬合曲線。

1.2.6.3 重復性實驗 稱取紫外轉化后的香菇粉2.00 g,采用正交試驗優化的最佳提取條件制備樣品溶液。提取液0.45 μm微孔濾膜濾過,直接進色譜系統分析。每處理3個重復。

1.2.6.4 精密度實驗 選取1.2.6.3重復性試驗中的所制備樣品溶液一個,連續測定5次。

1.2.6.5 穩定性實驗 選取1.2.6.3重復性試驗中的所制備樣品溶液,分別在0、2、4、8、12和24 h進樣10 μL測定。

1.2.6.6 加樣回收率實驗 取已知麥角甾醇和VD2含量的香菇粉3份,按照已知量的80%、100%和120%添加相應的標準品,分別加入5.74、7.18、8.62 mg麥角甾醇標準品,197.63、247.04、296.45 μg VD2標準品,按正交試驗優化的最佳提取工藝條件制備樣品溶液,依次測定,計算麥角甾醇和VD2回收率。

1.2.7 其他提取方法對比試驗

1.2.7.1 皂化回流提取 精確稱取1.00 g紫外轉化后的香菇粉,混懸于32 mL KOH-EtOH溶液中,磁力攪拌器中85 ℃下回流提取3 h,所得混懸液3500 r/min離心10 min,收集上清液于分液漏斗中,加入10 mL正庚烷進行萃取,靜置后收集上層有機相,下層再用等體積萃取劑萃取兩次,合并三次萃取液,于旋轉蒸發儀蒸干有機溶劑,然后用無水乙醇溶解并定容至10 mL。提取液0.45 μm微孔濾膜濾過,直接進色譜系統分析。每處理3個重復[18]。

1.2.7.2 無水乙醇超聲波輔助提取 精確稱取1.00 g紫外轉化后的香菇粉,加入20 mL無水乙醇制成混懸液,50 ℃超聲(500 W)提取20 min,3500 r/min離心10 min,收集上清液,殘渣再加20 mL無水乙醇,重復上述操作,合并提取液,無水乙醇定容至40 mL。提取液0.45 μm微孔濾膜濾過,直接進色譜系統分析。每處理3個重復[11]。

1.2.7.3 KOH-EtOH超聲波輔助提取 精確稱取0.20 g紫外轉化后的香菇粉,用10 mL KOH-EtOH溶液進行溶解,60 ℃超聲(500 W)提取40 min,3500 r/min離心10 min,收集上清液,殘渣再加10 mL KOH-EtOH溶液,60 ℃超聲(500 W)提取40 min,重復上述操作,合并2次上清液,置于分液漏斗中,加入10 mL正庚烷進行萃取,靜置后收集上層有機相,下層再用等體積萃取劑萃取兩次,合并三次萃取液,于旋轉蒸發儀蒸干溶劑,然后用無水乙醇進行溶解,并定容至10 mL。提取液0.45 μm微孔濾膜濾過,直接進色譜系統分析。每處理3個重復[10]。

1.2.7.4 微波輔助提取 精確稱取0.050 g紫外轉化后的香菇粉,溶解于5 mL KOH-EtOH溶液中,520 W微波處理100 s,所得混懸液3500 r/min離心10 min,收集上清液于分液漏斗中,10 mL石油醚(60～90 ℃)萃取三次,合并萃取液,蒸除溶劑,無水乙醇溶解定容至10 mL。提取液0.45 μm微孔濾膜濾過,直接進色譜系統分析。每處理3個重復[18]。

1.3 數據處理

采用SPSS 16.0軟件對計算處理后的數據進行統計分析,采用Tukey法進行方差分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取時間對香菇粉中麥角甾醇和VD2提取效率的影響 結果表明(圖1)不同提取時間對香菇中麥角甾醇和VD2的提取效率影響較大,其中20 min的麥角甾醇和VD2含量均最高,是5、10、40 min時麥角甾醇提取含量的1.25、1.19和1.01倍,VD2提取含量的1.18、1.12和1.04倍,而20和40 min時麥角甾醇和VD2提取含量間均無顯著差異(P>0.05),但兩者均與5和10 min的提取含量差異顯著(P<0.05)。當以40 min為提取時間對食用菌中麥角甾醇和VD2進行提取時,耗費時間較長,提取效率無顯著提高。綜合考慮提取效率、節約能源和經濟性,確定麥角甾醇和VD2提取時間為5～20 min。

圖1 提取時間對麥角甾醇和VD2提取效果的影響

2.1.2 超聲波功率對香菇粉中麥角甾醇和VD2提取效果的影響 結果表明(圖2)不同超聲波功率對香菇中麥角甾醇和VD2的提取效率有一定影響,其中超聲波功率為100、200、400 W時麥角甾醇和VD2提取含量間均無顯著差異(P>0.05),超聲波功率為100、400和800 W時VD2提取率差異也不顯著(P>0.05)。當超聲波功率為100和400 W時,重復性較200 W差;當超聲波功率為800 W時,其VD2和麥角甾醇的提取效果較好,但在實際操作中,液體飛濺現象嚴重。綜合考慮提取效率、節能性和可操作性,確定麥角甾醇和VD2超聲波提取功率為100～400 W。

圖2 超聲波功率對麥角甾醇和VD2提取效果的影響

2.1.3 微波功率對香菇粉中麥角甾醇和VD2提取效果的影響 結果表明(圖3)不同微波功率對香菇中麥角甾醇和VD2的提取效率有一定影響,在100、200、400和800 W提取條件下,其VD2和麥角甾醇的提取效果相比均無顯著差異(P>0.05)。當微波功率為100 W時,其VD2提取含量是50、200、400 W時的1.07、1.03和1.02倍,其麥角甾醇提取含量是50、200、400 W時的1.10、1.02和1.00倍。綜合考慮提取效果和節能兩方面因素,確定香菇粉中麥角甾醇和VD2的微波提取功率為100～400 W。

圖3 微波功率對麥角甾醇和VD2提取效果的影響

2.2 正交優化實驗結果

正交試驗結果及分析見表2～表4。結果表明影響香菇粉中麥角甾醇和VD2提取效果的先后順序為:提取時間(A)>微波功率(C)>超聲波功率(B)。方差分析結果表明提取時間對麥角甾醇和VD2提取效果有極顯著影響(P<0.001),超聲波功率對香菇粉中麥角甾醇和VD2提取效果無顯著影響(P>0.05),微波功率對香菇粉中VD2提取效果有顯著影響(P<0.05),而對麥角甾醇提取效果無顯著影響(P>0.05)。正交試驗優化得出的條件為A3B3C2,即室溫條件下,超聲波功率400 W,微波功率200 W,對料液比為1∶20 (g/mL)的樣品溶液提取20 min。此條件下,香菇粉中麥角甾醇含量高達(3.59±0.69) mg/g(n=3),VD2含量高達(123.52±0.69) μg/g(n=3)。

表2 正交試驗結果分析(n=3)

表3 麥角甾醇含量方差分析結果

表4 VD2含量方差分析結果

2.3 含量測定方法學考察

由圖4可知,所用色譜條件下,單樣品總分析時間11 min,麥角甾醇和VD2的保留時間分別為7.6和5.7 min左右,麥角甾醇、VD2與相鄰色譜峰均能達到較好的分離,且出峰時間合適,峰形較好,干擾少。麥角甾醇和VD2測定的回歸方程、線性范圍、回收率、精密度、穩定性和重復性結果見表5。

表5 麥角甾醇和VD2測定的回歸方程、線性范圍、回收率、精密度、穩定性和重復性

圖4 麥角甾醇標準品(A)、VD2標準品(B)溶液及樣品溶液(C)HPLC色譜圖

2.4 不同提取方法提取效果比較

不同提取方法提取效果比較見表6。結果表明,優化后超聲波微波協同提取法在提取溫度(室溫)、提取時間(20 min)、提取次數(1次)、提取效果(麥角甾醇3.59 mg/g,VD2123.52 μg/g)、重現性(1.11%和0.55%)等方面,與其他四種現有提取方法不同程度具有明顯的優勢,且該法僅需要提取一次后離心定容,不涉及多次萃取、蒸除溶劑、溶解定容等繁瑣步驟,具有良好的操作簡便性。

表6 超聲波微波協同提取法與其他提取方法比較

3 結論

采用超聲波-微波協同提取的方法,通過單因素和正交試驗對香菇粉中麥角甾醇和VD2的提取工藝進行優化。結果表明,各因素對麥角甾醇和VD2提取效率的影響程度依次為提取時間>微波功率>超聲波功率,最終優化提取條件為:無水乙醇為提取溶劑,提取時間20 min,料液比1∶20 (g/mL),提取溫度為室溫,超聲波功率為400 W,微波功率為200 W。在該提取條件下,麥角甾醇含量高達(3.59±0.69) mg/g,VD2含量高達(123.52±0.69) μg/g。麥角甾醇的平均回收率(n=6)為114.57%,RSD(n=6)為3.83%,VD2平均回收率(n=6)為102.26%,RSD(n=6)為4.95%。該法同比已有方法提取效率高,提取和分析時間短,操作簡便,且具有較好的準確性及重現性。