響應面法優化結香花總黃酮提取工藝及其抗氧化活性

張意笠,程汝濱,黃 真,余水生,周樟平,鐘曉明,*

(1.浙江中醫藥大學藥學院,浙江杭州 310053;2.浙江九龍山國家級自然保護區管理局,浙江遂昌 323300;3.遂昌縣科技局,浙江遂昌 323300)

結香(EdgeworthiachrysanthaLindl.)為瑞香科結香屬落葉灌木,主要分布于長江流域以南以及河南、陜西等地[1]。據《藥用植物辭典》記載[2],結香的花蕾、根、莖皮均可入藥。結香花為結香的花蕾,別名打結花、金腰袋、夢冬花等[1],具有養陰、安神、明目、祛障翳等功效。研究表明,結香花含有豐富的香豆素類、黃酮類、有機酸和甾體等化合物[3-5]。

近年來,隨著人們對“綠色消費”、“回歸自然”理念的重視,大眾對含有植物提取物產品的認可度不斷提升,天然植物提取物的商業價值越來越高,國際上對植物提取物的需求量也越來越大[6-7]。黃酮類化合物作為一種多羥基酚類物質的次生代謝產物,普遍存在于自然界中。植物黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性,已在許多行業得到廣泛應用[8-9]。目前提取結香花中黃酮類物質的工藝主要有回流提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法[10]等。徐玲[11]通過比較回流提取法、超聲波提取法和閃式提取法三種方法,結果顯示回流提取法操作簡單且得率較高,通過正交試驗得到最優工藝下的黃酮得率為7.2 mg·g-1。但響應面法優化結香花總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究未見報道。

因此,為促進結香花資源的開發利用和深入研究,本研究以結香花為原料,在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken法優化結香花中總黃酮的提取工藝,并從其清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力初步研究結香花總黃酮抗氧化活性,旨在為更好地開發利用結香花資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

結香花 采自浙江省麗水市遂昌縣高坪鎮,經浙江中醫藥大學藥學院中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為瑞香科結香屬結香EdgeworthiachrysanthaLindl的花蕾;蘆丁對照品 上海源葉生物科技有限公司,批號:T27F10Z81699;1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 上海源葉生物科技有限公司,批號:W27F10E81251;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 酷爾化學,批號:54C1201V;L-抗壞血酸(VC) Sigma,批號:WXBB4747V;無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、過硫酸鉀 國藥集團化學試劑有限公司。

DZF數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司;AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀 上海榮亞生化儀器廠;HH-S數顯恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;UV-1800型紫外分光光度計 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 結香花總黃酮的提取 結香花在60 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重,粉碎,過50目篩,得樣品粉末。稱取1.00 g,在一定的乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時間的條件下進行回流提取,然后將得到的提取液抽濾,定容至50 mL容量瓶,備用。

1.2.2 總黃酮的測定

1.2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 參考文獻[12]并加以修改,精密稱取蘆丁對照品25.0 mg,加70%乙醇定容至25 mL容量瓶,搖勻,即得1.0 mg·mL-1對照品溶液。精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL對照品溶液于25 mL比色管中,各加水至6 mL,分別加入5% NaNO2溶液1 mL,混勻后靜置6 min,加10% Al(NO3)3溶液1 mL,混勻后靜置6 min,再加4% NaOH溶液10 mL,加水至刻度,混勻,靜置15 min,于510 nm波長處測定吸光度(A)。以吸光度(A)對蘆丁質量濃度(X)進行回歸,得到回歸方程為A=0.2738X-0.0032(R2=0.9993)在0.02～0.12 mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

1.2.2.2 結香花總黃酮的測定 準確量取樣品溶液4.0 mL于25 mL比色管中,按照“1.2.2.1”中所述方法進行操作,按下式計算總黃酮得率。

式中,Y為總黃酮得率(mg·g-1),C為結香花總黃酮的質量濃度(mg·mL-1),V為測量總黃酮提取液體積(mL),N為稀釋倍數,M為稱量的結香花干品質量(mg)。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 固定液料比20∶1,提取溫度60 ℃,提取時間60 min,考察乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%對總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 液料比對總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度80%,提取溫度60 ℃,提取時間60 min,考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對總黃酮得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度80%,液料比30∶1,提取時間60 min,考察提取溫度50、60、70、80、90 ℃對總黃酮得率的影響。

1.2.3.4 提取時間對總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度80%,液料比30∶1,提取溫度80 ℃,考察提取時間30、60、90、120、150 min對總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應面試驗 根據單因素實驗結果,以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)作為影響因素,總黃酮得率為評價指標(Y),應用Box-Behnken中心組合進行4因素3水平的試驗設計。因素水平見表1。

表1 響應面實驗設計因素與水平

1.2.5 結香花總黃酮抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測定 參考文獻[13]并加以修改,將最佳工藝條件下得到結香花總黃酮溶液配制成0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg·mL-1質量濃度的樣品溶液。取1 mL樣品溶液,加入5 mL 0.06 mmol·L-1DPPH乙醇溶液,充分混勻,在室溫下避光反應30 min,于517 nm波長處測定吸光度。并以L-抗壞血酸(VC)作為陽性對照(濃度為0.01、0.02、0.04 mg·mL-1),按以下公式計算清除率。

式中,A0為1 mL蒸餾水+5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度;A1為1 mL樣品+5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度;A2為1 mL樣品+5 mL無水乙醇的吸光度。

1.2.5.2 ABTS自由基清除率測定 參考文獻方法[14]并改進,將7 mmol·L-1的ABTS溶液與2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液1∶1混合均勻,在室溫避光的條件下靜置過夜,制成ABTS貯備液。在12～16 h之內測定,測定時用蒸餾水稀釋,使其在734 nm波長下的A值為0.700±0.020。

將最佳工藝條件下得到結香花總黃酮溶液配制成0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg·mL-1質量濃度的樣品溶液。取0.1 mL樣品溶液,加入3.9 mL ABTS貯備液,充分混勻,在室溫下避光反應10 min,于734 nm波長處測定吸光度。以L-抗壞血酸(VC)作為陽性對照(濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20 mg·mL-1),按以下公式計算清除率。

式中,A0為0.1 mL蒸餾水+3.9 mL ABTS自由基工作液的吸光度;A1為0.1 mL樣品+3.9 mL ABTS自由基工作液的吸光度;A2為0.1 mL樣品+3.9 mL蒸餾水的吸光度。

1.3 數據處理

所有試驗平行測定3次,運用響應面分析軟件Design Expert 8.0.6及GraphPad Prism 7.0進行相關圖表的繪制以及數據的處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度的影響 由圖1可知,總黃酮得率隨著乙醇濃度增大先升后降,并在乙醇濃度80%時達到最大值。這與錢慧琴等[15]的研究報道中乙醇濃度對于總黃酮得率影響的變化趨勢一致。這可能是因為乙醇濃度為80%時,結香花黃酮類物質的溶出趨于飽和,隨著乙醇濃度增加,提取溶劑的極性相對降低,促進結香花中極性小的成分溶出,從而使得總黃酮得率下降。因此選擇乙醇濃度70%～90%進行響應面優化試驗。

圖1 乙醇體積分數對結香花總黃酮得率的影響

2.1.2 液料比的影響 由圖2可知,總黃酮得率隨著液料比的增大先升后略有下降,并在液料比30∶1時達到最大值。這與王慧芳等[16]研究中的液料比對總黃酮得率影響的研究結果一致。這可能是因為隨著液料比的增大,增加了溶質與溶劑的接觸面積,有利于黃酮類物質溶出;當液料比為30∶1時,黃酮類化合物的溶出逐漸趨于平穩;繼續增加液料比,非黃酮類雜質溶出增多且還會造成資源的浪費。因此,選擇液料比20∶1～40∶1進行響應面優化試驗。

圖2 液料比對結香花總黃酮得率的影響

2.1.3 提取溫度的影響 由圖3可知,總黃酮得率隨著溫度的升高先升后下降,并在提取溫度80 ℃時達到最大值。這與秦晶晶等[17]的研究報道中提取溫度對總黃酮得率的影響的變化趨勢一致。當溫度升高,分子的熱運動加劇,總黃酮的溶出越多,得率越高。當溫度升高到一定程度后,黃酮類物質的結構遭到破壞,使得率有所下降。因此選擇提取溫度70～90 ℃進行響應面優化試驗。

圖3 提取溫度對結香花總黃酮得率的影響

2.1.4 提取時間的影響 由圖4可知,總黃酮得率隨著時間的增加先升后下降,并在提取時間90 min時達到最大值,這表明在90 min時總黃酮已提取完全,隨著提取時間增長,可能會使一些熱不穩定成分在長時間提取中遭到破壞,導致總黃酮得率下降。因此選擇提取時間60～120 min進行響應面優化試驗。

圖4 提取時間對結香花總黃酮得率的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果 在單因素實驗基礎上,以乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時間為自變量,以總黃酮得率為響應值,采用Design-Expert 8.0.6軟件設計4因素3水平,結果見表2,得到總黃酮得率關于乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)和提取時間(D)的二階多項式方程:

表2 響應面試驗設計及結果

Y=22.57-0.10A+1.44B+0.5C-0.23D+0.30AB+1.94AC+0.60AD+0.64BC-0.43BD-0.84CD-1.80A2-1.66B2-1.97C2-2.24D2

表3 方差分析

2.2.3 交互作用分析 為評價兩兩交互作用對總黃酮得率的影響并確定各因素的最佳水平范圍,分別繪制各因素交互作用影響的響應曲面,如圖5。響應曲面的形狀反映了兩因素的交互效應,曲面走勢越陡峭,表明兩因素交互作用對響應值的影響越顯著[18-19]。由圖5可知,乙醇濃度和提取溫度(圖5B),液料比和提取溫度(圖5D)以及提取溫度和提取時間(圖5F)兩者交互作用顯著,表現為響應面曲線走勢陡峭。

圖5 各因素對總黃酮得率的3D響應面圖

2.2.4 最佳條件預測及驗證試驗 響應面結果分析可知,最佳提取條件為乙醇濃度81.68%,液料比35.29∶1,提取溫度83.25 ℃,提取時間85.74 min,預測總黃酮得率為23.04 mg·g-1。考慮到實際操作,最終將其確定為乙醇濃度80%,液料比35∶1,提取溫度83 ℃,提取時間85 min。此條件下對建立的數學模型進行驗證試驗,獲得的結香花總黃酮得率的實際測得值為22.76±0.03 mg·g-1,預測值為23.04 mg·g-1,誤差為1.23%,小于3%,因此證實了預測值的準確可靠。

2.3 抗氧化活性實驗結果

2.3.1 DPPH自由基清除率 由圖6可知,當結香花總黃酮質量濃度在0.20～2.00 mg·mL-1范圍內,對DPPH自由基的清除率隨著質量濃度的增加而增大,且兩者存在一定的量效關系。經Graphpad Prism 7計算得結香花總黃酮提取物和VC對DPPH自由基的半數清除率IC50值分別為0.75 mg·mL-1、12.21 μg·mL-1。由此可見,結香花總黃酮對DPPH自由基具有一定的清除能力,但與VC相比能力較弱。

圖6 結香花總黃酮和VC的DPPH自由基清除能力

2.3.2 ABTS自由基清除率 由圖7可知,當結香花總黃酮質量濃度在0.20～2.00 mg·mL-1范圍內,對ABTS自由基的清除率隨著質量濃度的增加而增大,且兩者存在一定的量效關系。經Graphpad Prism 7計算得結香花總黃酮提取物和VC對ABTS自由基的半數清除率IC50值分別為0.98 mg·mL-1、61.12 μg·mL-1。由此可見,結香花總黃酮對ABTS自由基具有一定的清除能力,但與VC相比能力較弱。

圖7 結香花總黃酮和VC的ABTS自由基清除能力

3 結論

通過響應面法建立結香花總黃酮提取工藝的回歸方程,得到最佳提取條件為:乙醇濃度80%,液料比35∶1,提取溫度83 ℃,提取時間85 min,此條件下,結香花總黃酮得率為22.76±0.03 mg·g-1,相比徐玲[11]在正交工藝優化下的得率7.2 mg·g-1有了明顯的提升。體外抗氧化活性研究表明,結香花總黃酮對DPPH和ABTS自由基具有一定清除能力。本研究可為結香花總黃酮的進一步開發利用提供有效支持,為其在食品、藥品、保健品等領域開發天然抗氧化劑提供一定的理論依據。韓佳[20]研究也發現,結香花提取物的萃取部位均具有不同的抗氧化活性,其中乙酸乙酯萃取物的鐵還原能力最強,氯仿萃取物的清除超氧陰離子自由基能力最強,石油醚萃取物的清除羥基自由基和亞硝酸鹽的能力最強。目前遂昌地區的結香以干花作為藥用,主要銷往安徽亳州等藥材市場,加工成品以及深度開發少,其價格波動較大,經濟附加值不高。因此加強結香花的基礎研究工作,優化其提取的工藝和方法,開發以結香花及其提取物為主的系列產品,可拓寬結香在食品、保健品以及化妝品方面應用,推進結香花產品化,有助于遂昌地區結香資源的可持續發展,打造健康養生農業,建立產業綜合體[21]。