響應面法優化珍珠龍膽石斑魚肉肽的酶法制備工藝及酶解產物的抗氧化活性

徐 杰,林澤安,李子青,江彩珍,范秀萍,2,*,蘇偉明

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東湛江 524088;2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室,廣東湛江 524088)

珍珠龍膽石斑魚(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinephleuslanceolatus),俗稱龍虎斑,是目前中國南方地區海水養殖的主要經濟魚類[1]。其具有生長快、環境耐受性強、病害少、魚皮膠原蛋白含量高、肉質纖維細膩等優勢,目前以活體銷售為主要的消費模式,價格較高[1-4]。由于受到鮮活水產品保活流通方式與技術的限制,在運輸與銷售過程中的死亡個體很多,死亡個體通常以冰鮮的方式進行銷售,但價格便宜。

珍珠龍膽石斑魚肉是一種高蛋白、低脂肪的優質蛋白質原料,其背部肌肉的蛋白質(干基)含量甚至達到85.19%,可以作為各類蛋白與多肽類產品的原材料[5-6]。國內外關于魚肉肽的提取制備及其活性研究主要有羅非魚[7-8]、鱈魚[9-10]、鮐鲅魚[11-13]及一些淡水魚[14-16]等,且以酶法制備為主,該法具有條件溫和、效率高等優勢;同時也有采用發酵法制備抗氧化肽的。但對石斑魚精深加工的相關研究報道還相對較少,因此,對珍珠龍膽石斑魚肉的開發利用是目前研究的重要方向[2,17]。

本實驗以珍珠龍膽石斑魚肉為原材料,采用生物酶解法制備石斑魚肉肽,以水解度和1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率為指標,利用單因素實驗及響應面優化的方法探究最佳酶解條件,并采用DPPH自由基清除率、羥基自由基(·OH)清除率和總還原力為抗氧化指標來評價其酶解產物及超濾分離組分的抗氧化活性,以期為珍珠龍膽石斑魚的精深加工提供新的方法與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活珍珠龍膽石斑魚 購于霞山水產品批發市場;風味蛋白酶(3×104U/g)、堿性蛋白酶(15×104U/g)、木瓜蛋白酶(21×104U/g)、中性蛋白酶(20×104U/g)、動物蛋白酶(23×104U/g) 購自廣西南寧東恒華道生物科技有限責任公司;甲醛、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、硼酸、三氯乙酸、硫酸、鄰二氮菲、H2O2、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵 購自廣州市金華大化學試劑有限公司,均為分析純;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-dipHenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 購自上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;BSA224S-CW型萬分之一電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;JY12002型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;5810R臺式高速大容量冷凍離心機 艾本德中國有限公司;Sorvall LYNX 6000高速落地離心機 美國賽默飛世爾科技公司;Varioskan Flash酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司;高速組織搗碎機 上海標本模型廠;pHS-3C型雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;T18高速分散機ULTRA-TURRAX 德國IKA公司;Mini pellicon型超濾裝置 默克密理博實驗室設備(上海)有限公司;FD-551型冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司;Vapodest凱氏定氮儀 德國格哈特分析儀器有限公司;N-1100V-WB型旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 鮮活石斑魚,取其背部及腹部肌肉(注意不要割破血管),用生理鹽水清洗后拭干,于高速組織搗碎機中搗碎,分裝,置于-20 ℃冰箱冷凍保存備用。

1.2.2 酶法制備工藝 實驗時取出冰凍的珍珠龍膽石斑魚肉糜于室溫解凍,之后稱取一定量解凍后的石斑魚肉糜于燒杯中按料水比加入蒸餾水,再依此調節pH、溫度,按酶添加量加入酶劑在水浴鍋中酶解,酶解到特定時間后迅速取出燒杯,在沸水浴中滅酶10 min,再等冷卻至室溫后,分裝于離心管中,在4000 r/min的條件下離心10 min,取其上清液,再依此進行超濾分級、旋轉蒸發濃縮、真空冷凍干燥,最終得到干燥粉末產品。

1.2.3 酶的選擇 取魚肉20 g,分別加入400 U/g的風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白酶,pH為7.0(堿性蛋白酶為pH8.0)及溫度為50 ℃,料水比1∶5(魚肉與水質量體積比,g/mL)酶解4 h,測得水解度(DH)及DPPH自由基清除率,選取最佳作用酶。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 料水比對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風味蛋白酶,酶添加量400 U/g,在pH7.0、50 ℃條件下酶解4 h,設置不同料水比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察料水比對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.2 pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風味蛋白酶,酶添加量400 U/g,在50 ℃、料水比1∶4條件下酶解4 h,設置不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.3 酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風味蛋白酶,酶添加量400 U/g,在pH7.0、50 ℃、料水比1∶4條件下酶解,設置不同時間(2、3、4、5、6、7 h),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.4 酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風味蛋白酶,酶添加量400 U/g,在pH7.0、料水比1∶4條件下酶解5 h,設置不同溫度(40、45、50、55、60 ℃),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.5 酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風味蛋白酶,在pH7.0、55 ℃、料水比1∶4條件下酶解5 h,設置不同酶添加量(150、300、600、900、1200 U/g),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.5 酶解工藝優化 根據Box-Benhnken中心組合實驗設計原理[18],運用 Design-Expert V8.0.6.1軟件,基于單因素實驗結果,采用4因素3水平的響應面分析法,固定酶解pH7.0,以料水比(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶添加量(D)為自變量,酶解液水解度(DH,Y)為響應值,各因素三個水平采用-1、0、1進行編碼,因素水平和編碼見表1。

表1 Box-Benhnken試驗因素水平設計

1.2.6 水解度測定 原料總氮含量用凱氏定氮法(GB 5009.5-2016)測定;氨基酸態氮用酸度計法(GB 5009.235-2016)測定。水解度(DH)的計算公式為:

DH(%)=(水解液中氨基態氮-原料中游離氨基態氮)/(原料中總氮含量-原料中非蛋白氮)×100

1.2.7 珍珠龍膽石斑魚肉酶法制備上清液及超濾分離 根據Box-Behnken實驗優化確定的酶法制備的最佳工藝參數,制備珍珠龍膽石斑魚肉粗酶解產物(EH)。選用截留不同分子量的超濾膜(8、5、3 kDa)對酶解上清液進行分離純化后冷凍干燥,分別得到不同的超濾組分:EH-1(>8 kDa)、EH-2(5～8 kDa)、EH-3(3～5 kDa)和EH-4(<3 kDa)。

1.2.8 酶解上清液及超濾組分的抗氧化活性測定

1.2.8.1 DPPH自由基清除率的測定 參照Nurdiani等[19]的方法并略有修改,取0.4 mL不同質量濃度的樣品溶液,加入0.4 mL新配制DPPH溶液(1×10-4mol/L),搖勻、室溫下避光放置30 min,于517 nm波長處測定吸光度(A1);以等量無水乙醇代替DPPH溶液重復上述步驟,測定吸光度(A2);以等量無水乙醇代替樣品溶液重復上述步驟,測定吸光度(A3)。清除率(Q)按下列公式計算:

1.2.8.2 羥基自由基(·OH)清除率的測定 參照Wang[20]的方法并略有修改,取0.3 mL鄰二氮菲乙醇溶液(5 mmol/L),加入0.2 mL的磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L,pH7.40)和0.3 mL的FeSO4溶液(0.75 mmol/L),加入待測不同質量濃度的樣品溶液1 mL混勻后,加入0.2 mL的H2O2(0.1%)搖勻,37 ℃條件下水浴60 min,于536 nm波長處測定吸光度(A1);以等量磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L,pH7.40)代替鄰二氮菲乙醇溶液、FeSO4溶液和H2O2溶液重復上述步驟,測定吸光度(A2);以等量超純水代替樣品溶液和H2O2溶液重復上述步驟,測定吸光度(A3);以等量超純水代替樣品溶液重復上述步驟,測定吸光度(A4)。清除率(Q)按下列公式計算:

1.2.8.3 總還原力的測定 參照袁燕[21]的方法并略有修改,取1 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6),加入0.1 mL待測不同質量濃度的樣品溶液和1 mL的鐵氰化鉀溶液(1%),50 ℃條件下水浴反應20 min后迅速冷卻,加入1 mL的三氯乙酸溶液(10%),3000 r/min離心20 min,取上清液1 mL,加入1 mL超純水和0.2 mL的FeCl3溶液(0.1%),混勻后室溫放置10 min,測定700 nm的吸光值。

1.3 數據處理

采用MS Excel 2010軟件作圖;采用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行響應面優化分析;采用IC50計算軟件計算IC50值,實驗結果均以(X±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 酶的選擇

如圖1所示,在相同酶活力添加量的情況下,五種蛋白酶的水解效果如下:水解度:風味蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶>動物蛋白酶>堿性蛋白酶;DPPH自由基清除率:風味蛋白酶>堿性蛋白酶>動物蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶。由于酶具有專一性的特點,其與底物反應有一定特異性,在不同蛋白酶的酶解下,魚肉水解所得的短肽有一定差異,從而影響水解度和DPPH自由基清除率。所以綜合水解度及DPPH自由基清除率兩組實驗數據,選取風味蛋白酶來進行單因素實驗及響應面優化,以確定該酶對于珍珠龍膽石斑魚肉的最佳酶解條件。陳周[22]、田裕心[23]等均表明用風味蛋白酶對水產品進行酶解,其酶解效果及風味均有較好改善。

圖1 不同蛋白酶對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2 單因素實驗

2.2.1 不同料水比對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖2所示,隨著水添加量的上升,水解度先上升后下降,DPPH自由基清除率在1∶2的料水比時出現最低值;在料水比為1∶1時,DPPH自由基清除率高達96.86%,可能是由大分子的蛋白復合物也具有自由基清除作用。料水比小于1∶4時,酶與魚肉的結合較為緊密,呈現飽和,所以水解度達到最大值6.20%,抗氧化短肽含量也在增加;當料水比大于1∶4時,勻漿液中酶與魚肉蛋白結合較松散,造成水解度在后期呈現下降趨勢;并且使得魚肉中抗氧化肽的析出變緩,所以其DPPH自由基清除率趨于平緩。因此,酶解料水比應選擇1∶4為佳。

圖2 不同料水比對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2.2 不同pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖3所示,當pH<7時,水解度先迅速上升后變為平緩,DPPH自由基清除率均處于較低水平,當pH7時,水解度及DPPH自由基清除率達到最高,而后呈下降趨勢。這是由于酶的活性受pH影響較大,pH越低或越高,對酶活力的影響都很大,從而影響酶的催化效果,風味蛋白酶是一種中性蛋白酶,在pH7.0時有水解度最高且DPPH自由基清除率達到99.19%。從圖3可知,當pH5.5時與pH7.0時的DPPH自由基清除率均達到90%以上,按照趨勢pH5.5時DPPH自由基清除率應該最低,推測是由于pH較低時水解度較低,離心之后上清液依舊含有固體懸浮物,對DPPH自由基清除率的測定造成了一定影響。因此,酶解pH應選擇7.0為佳。

圖3 不同pH對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2.3 不同酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖4所示,當酶解時間小于5 h時,水解度及DPPH自由基清除率均隨時間的延長而上升;當時間到達5 h時,達到最高,隨后趨于平緩。當在加酶量與料水比一定時,酶與魚肉作用的程度有限,延長時間可以使其充分反應,游離氨基酸及抗氧化肽析出上升,水解度及清除率增加;但當達到體系限度時趨于平緩,游離氨基酸及抗氧化肽析出飽和,水解度及清除率液趨于平緩。因此,酶解時間應選擇5 h為佳。

圖4 不同酶解時間對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2.4 不同酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖5所示,當溫度低于55 ℃時,水解度隨溫度的升高明顯增加,DPPH自由基清除率無顯著變化;當溫度高于55 ℃時,水解度及DPPH自由基清除率均呈下降趨勢。這是由于溫度時影響酶活力的主要因素之一,當溫度低于55 ℃時,隨著溫度的上升,酶解速度加快,水解速度增大;當溫度高于55 ℃時,酶失活嚴重,酶解速度降低,抗氧化肽析出減少,所以水解度及DPPH自由基清除率均下降。因此,酶解溫度應選擇55 ℃為佳。

圖5 不同酶解溫度對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2.5 酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖6所示,當酶添加量低于900 U/g時,水解度和DPPH自由基清除率均隨酶添加量的增加而上升;當酶添加量大于900 U/g時,水解度基本趨于平緩,DPPH自由基清除率有所下降。當酶添加量增加的時候,底物總量不變,體系在其他因素滿足的條件下,酶解液中的游離氨基態氮含量會飽和,所以水解度后期趨于平緩;當酶添加量增加的時候,酶解上清液的顏色加深,且腥味更重,可能會影響酶解產物中抗氧化肽的活性,造成DPPH自由基清除能力下降。因此,酶添加量應選擇900 U/g為佳。

圖6 不同酶添加量對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.3 Box-Benhnken試驗結果

2.3.1 Box-Benhnken試驗設計及結果 根據單因素實驗的結果,利用Design-Expert V8.0.6.1軟件設計與分析,設計試驗方案及結果如表2所示,以水解度(DH)為響應值,共設計29組試驗方案,包含24組析因試驗組及5個中心試驗組。同時也檢測了每組的DPPH自由基清除率。但以DPPH自由基清除率為響應值進行分析時,模型整體不顯著,因此文中僅以水解度作為響應值進行分析。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對響應值與各因素編碼值進行回歸擬合后,得到回歸方程[24]:

Y=8.51+0.18A+0.43B-0.47C+0.54D-0.26AB-0.19AC-0.017AD-0.17BC+0.052BD-0.055CD+0.049A2+0.14B2-0.69C2+0.14D2

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 響應面的交互作用分析 根據Design-Expert V8.0.6.1軟件,獲得響應值的3D曲面圖,分析各因素對水解度的影響及各因素間的交互作用,響應面圖等高線的形狀反應交互作用的強弱,圓形表示兩因素交互作用不明顯,而橢圓則表示交互作用明顯[25-26]。圖7(a)(b)(c)所示,酶解溫度和料水比、酶解溫度和酶解時間、酶添加量和酶解溫度均存在不顯著的交互作用,與方差分析結果相符。當固定料水比、酶解時間、酶添加量三個因素在零水平時,酶解溫度對水解度的影響均先呈現快速上升趨勢,溫度達到某一定值后緩慢下降。

圖7 兩因素的交互作用的響應面圖

2.3.3 最佳酶解工藝參數的確定 根據Box-Benhnken實驗結果與回歸分析,可得到珍珠龍膽石斑魚肉酶解的最佳工藝參數為:酶解pH7.0、料水比1∶3.50、酶解時間5.50 h、酶解溫度53.24 ℃、酶添加量1049.96 U/g,在此條件預測的水解度為10.05%。為方便實驗操作將實驗條件定為酶解pH7.0、料水比1∶3.5、酶解時間5.5 h、酶解溫度53 ℃、酶添加量1050 U/g。為驗證響應面的可行性,用此最佳工藝參數進行驗證性實驗,設置三組平行實驗,實驗所得到的水解度為9.99%±0.39%,與理論值誤差在±1%以內,說明采用響應面優化得到的酶法制備的最佳工藝參數準確可靠。

2.4 石斑魚肉酶解產物的抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基清除率的影響 DPPH自由基是很穩定的以氮為中心的自由基,常用于體外清除自由基活性評價[27]。如表4所示,珍珠龍膽石斑魚酶解產物及超濾組分對DPPH自由基有一定的清除能力,EH、EH-1、EH-2、EH-3和EH-4對DPPH自由基清除率的IC50值均低于抗壞血酸的清除能力(VC的IC50值為(3.02±0.35) μg/mL)。但一般認為某種物質DPPH自由基清除率的IC50值<10 mg/mL時,即可認為有較好的抗氧化性[28]。所以本實驗所得珍珠龍膽石斑魚酶解產物是一種DPPH自由基清除能力較高的產品,且優于段宙位等[6]制備的石斑魚酶解產物,其DPPH自由基清除率的IC50值為1.18 mg/mL。

2.4.2 對羥基自由基(·OH)清除率的影響 羥基自由基(·OH)是一種氧化能力很強的活性氧自由基,對身體有很大的損傷性[29]。根據鄰二氮菲比色法,可以測得其清除能力的強弱。如表4所示,石斑魚酶解產物對羥基自由基(·OH)有一定的清除能力,EH-2和EH-3的羥基自由基(·OH)清除能力較強。但低于抗壞血酸的清除能力(VC的IC50值為(0.24±0.02) μg/mL)。

表4 VC和石斑魚肉酶解產物的DPPH、羥基自由基清除作用的IC50

2.4.3 對總還原力的影響 物質的自身的抗氧化能力與還原性質有關,通過測定總還原力來表示抗氧化能力的強弱,還原力越強,抗氧化能力越強[30]。如圖8所示,石斑魚酶解產物隨質量濃度的上升而還原能力增強,其粗酶解產物的還原力明顯高于超濾組分,可能是由于超濾分離將某些還原性物質拆分,造成超濾分離產品的還原力下降。抗壞血酸的還原能力明顯比石斑魚酶解產物強,但酶解產物仍具有一定還原能力,這與DPPH自由基清除能力及羥基自由基(·OH)清除能力表現的抗氧化能力相似。

圖8 VC(a)和石斑魚肉酶解產物(b)的總還原力

3 結論

珍珠龍膽石斑魚肉是一種優質的蛋白源,經風味蛋白酶在pH7.0、料水比1∶3.5、酶解時間5.5 h、酶解溫度53 ℃、酶添加量1050 U/g條件下,得到具有抗氧化活性的酶解產物,其水解度為9.99%±0.39%。酶解產物及超濾組分的DPPH自由基清除能力IC50值在0.63～0.88 mg/mL之間;超濾組分EH-2(5～8 kDa)和EH-3(3～5 kDa)羥基自由基清除能力IC50值分別為16.94和16.38 mg/mL;酶解產物及超濾組分均具有較明顯的還原能力。本研究通過響應面法優化珍珠龍膽石斑魚肉制備蛋白肽工藝,所得的制備條件有效可行;且酶解產物及超濾組分均具有良好的抗氧化活性,可用于食品、藥品與化妝品等領域。