電子順磁共振波譜法測定三種類胡蘿卜素抗氧化活性

郭學文,全 力,蔣晨辰,陳 璐,喬俊琴,*,練鴻振

(1.生命分析化學國家重點實驗室,南京大學現代分析中心,江蘇南京 210093;2.南京中醫藥大學整合醫學學院,江蘇南京 210023)

自由基特別是活性氧自由基作為高活性中間體對人體代謝有著重要影響[1-2]。在病理狀態下或者衰老過程中,自由基的過量積累產生氧化應激會對人體造成危害[3-4],如炎癥[5]、神經退行性疾病[6-7]、心血管疾病[8]、糖尿病[9]和癌癥[10-11]等。因此外源抗氧化劑的篩選及其抗氧化能力比較受到人們廣泛關注[12-14]。

類胡蘿卜素是最常見的外源抗氧化劑之一,其優良的抗氧化性來源于不飽和共軛雙鍵結構,可清除人體內自由基。許多流行病學研究表明類胡蘿卜素可以降低多種癌癥、心血管疾病及其它慢性疾病的危險性[15-16]。β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素是人體血清中含量最多的三種類胡蘿卜素,廣泛存在于水果和蔬菜中,其良好的自由基清除能力使得它們可以用作食品抗氧化劑,并用于制造功能性食品及營養補充劑[17-19]。

目前測定物質抗氧化活性最常用的方法是紫外-可見分光光度(UV-Vis)法。作為自由基清除劑的抗氧化劑與在紫外-可見光范圍內有吸收的自由基反應,根據褪色程度確定其抗氧化活性[20-22],但類胡蘿卜素本身在紫外-可見光范圍內有吸收,會對紫外-可見分光光度法的檢測造成較大干擾[23-24]。電子順磁共振波譜(EPR)法是檢測自由基最直接的方法,EPR基于未成對電子在直流磁場中吸收電磁輻射后從低能級躍遷到高能級這一原理,可以避免類胡蘿卜素自身顏色對自由基檢測的干擾[25]。本文基于EPR法探討了1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)濃度與EPR信號強度關系,研究了Fenton法產生羥基自由基(·OH)中Fe2+和過氧化氫的濃度及比例對·OH信號強度的影響,通過比較β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素對DPPH·、·OH的清除能力,測定了三種類胡蘿卜素的抗氧化活性能力,為完善類胡蘿卜素等天然食品添加劑的抗氧化活性能力評價方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄紅素 純度為80%,上海源葉生物科技有限公司;葉黃素 純度為80%,薩恩化學技術(上海)有限公司;β-胡蘿卜素、DPPH 純度為96%,上海麥克林生化科技有限公司；5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-oxide,DMPO) 純度為96%,東仁化學科技(上海)有限公司;七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 純度97%,江蘇清禾化工有限公司;過氧化氫(H2O2，濃度30 wt%)、乙醇、丙酮 分析純,南京化學試劑有限公司;去離子水 超純水機(TM-D24UV純水/超純水一體化系統,美國Millipore公司)制備。

EMX 10/12電子順磁共振波譜儀 德國Bruker公司;G-9S紫外可見分光光度計 南京菲勒儀器有限公司;KH-300DB型超聲儀 昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EPR檢測方法 用毛細管(內徑0.9～1.0 mm)取100 μL樣品溶液,再將毛細管放入順磁石英管(內徑4 mm)進行EPR檢測。EPR測試參數如下:中心磁場:3480 Guass;掃場寬度:150 Guass;微波功率:20 mW;調制頻率:100 kHz;放大倍數:2×103;調制幅度:1 Guass;時間常數:40.96 ms;掃場時間:83.89 s;掃描次數:1;測試溫度:室溫。

1.2.2 標準曲線繪制

1.2.2.1 DPPH標準曲線 稱取一定質量的DPPH粉末,用乙醇超聲溶解配制成5 mmol/L儲備液備用。實驗時,用乙醇分別稀釋為濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00和2.00 mmol/L的DPPH溶液,按1.2.1中方法進行EPR測定,建立DPPH的EPR標準曲線。

1.2.2.2 DMPO-OH標準曲線和Fe2+與H2O2比例探索 稱取一定質量的FeSO4·7H2O粉末,用去離子水超聲溶解配制成5 mmol/L的FeSO4溶液作為儲備液;量取一定體積的H2O2溶液,用去離子水配制成50 mmol/L的H2O2儲備液;DMPO用去離子水配制成1 mol/L的溶液。考察Fe2+與H2O2不同比例時的EPR信號時,取20 μL DMPO溶液,分別加入20 μL FeSO4儲備液和2、10、20、30 μL H2O2儲備液,加去離子水至總體積為400 mL,此時混合液中FeSO4和H2O2摩爾比分別為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15,反應5 min后立即按1.2.1中方法進行EPR測定;建立DMPO-OH的EPR標準曲線時,取20 μL DMPO溶液,加入一定量的FeSO4儲備液和H2O2儲備液,加去離子水至總體積為400 mL,使混合液中FeSO4和H2O2濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L,反應5 min后立即按1.2.1中方法進行EPR檢測,建立DMPO-OH的EPR標準曲線。

1.2.3 自由基清除率測定 取番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素粉末,分別用丙酮超聲溶解,配制成1、2、3、4、5、6 mmol/L的待測樣品溶液備用。

1.2.3.1 DPPH·清除率的測定 根據Bartoszek等[26]的方法稍作調整。分別取40 μL不同濃度的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素樣品溶液(空白組取等量的丙酮溶液),加入到40 μL 5 mmol/L的DPPH溶液中,加乙醇使總體積為400 μL,混合均勻后按1.2.1中方法進行EPR檢測,其中考察濃度為0.2 mmol/L和0.5 mmol/L 的類胡蘿卜素對DPPH·清除率隨時間的變化時,將混合溶液黑暗條件下分別靜置30、60、150、210、270、330 min后進行檢測;考察濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mmol/L的類胡蘿卜素對DPPH·清除率時,將混合溶液黑暗條件下靜置160 min后進行檢測。自由基清除率(Radical scavenging activity,RSA)的計算公式為RSA(%)=(A0-A)/A0×100,其中A0為空白組特征峰的二次積分值,A為樣品組特征峰的二次積分值。

1.2.3.2 ·OH清除率的測定 根據Kladna等[27]的方法稍作調整。取40 μL不同濃度的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素樣品溶液(空白組取等量的丙酮溶液),加入20 μL FeSO4溶液(5 mmol/L)、20 μL DMPO溶液(1 mol/L),混合均勻后加入20 μL H2O2溶液(50 mmol/L),加去離子水使總體積為400 μL,混合均勻后立即按1.2.1中方法進行EPR檢測。其中考察DMPO-OH信號隨時間的變化時,將混合溶液黑暗條件下分別靜置5、10、15、20、25、30 min后進行檢測;考察濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mmol/L的類胡蘿卜素對·OH清除率時,將混合溶液液黑暗條件下靜置5 min后進行檢測。RSA(%)=(H0-H)/H0×100,其中H0為空白組第二特征峰的峰高,H為樣品組第二特征峰的峰高。

1.2.3.3 UV-Vis法對比 根據Zhang等[28]的方法稍作調整。取30 μL 5 mmol/L的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素樣品溶液(空白組取等量的丙酮溶液),加入到30 μL 5 mmol/L的DPPH溶液中(類胡蘿卜素自身吸光度測定時以等體積乙醇代替DPPH),加乙醇使總體積為3 mL,混合均勻后黑暗處靜置30 min后加入比色皿中,然后置于UV-Vis檢測517 nm波長處的吸光度,光譜掃描波長范圍:200～800 nm。RSA(%)=[H0-(H-Hc)]/H0×100,其中H0為空白組517 nm處吸光度,H為樣品組517 nm處吸光度,Hc為類胡蘿卜素自身517 nm處吸光度。

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次,結果以平均值±標準偏差表示,采用Bruker WinEPR Processing 2.22軟件對EPR數據進行處理,采用Origin 8.5對結果進行分析。

2 結果與討論

2.1 番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素對DPPH·清除率

DPPH是一種穩定的自由基,可以通過EPR直接測定其EPR信號譜圖,圖1為不同濃度DPPH的EPR譜圖及歸一化的二次積分值與濃度關系曲線。由圖1可知,在0.01～1.00 mmol/L范圍內DPPH濃度(C)與EPR譜圖二次積分值(I)成良好的線性關系,線性方程I=1.3033C+0.0028,相關系數R2=0.9949。因此,可以通過監測DPPH的EPR二次積分值來反映DPPH的濃度變化,進而用于DPPH·清除率的測定。實驗時,固定DPPH初始濃度為0.5 mmol/L用于類胡蘿卜素對DPPH·清除率的測定。

圖1 不同濃度DPPH的EPR譜圖(A)及積分值與濃度關系圖(B)

圖2顯示了濃度分別為0.2、0.5 mmol/L的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素對DPPH·(0.5 mmol/L)清除率隨時間的變化。由圖2可知,隨時間的延長,三種類胡蘿卜素對DPPH·的清除率均增大,且呈現前期隨時間增大迅速增大,后期增大趨勢變緩的趨勢,300 min后清除率幾乎保持不變。對同種類胡蘿卜素,高濃度(0.5 mmol/L)的類胡蘿卜素對DPPH·清除率高于低濃度(0.2 mmol/L)。其中,番茄紅素對DPPH·的清除速率最快,濃度為0.2和0.5 mmol/L的番茄紅素對DPPH·的清除率在30 min時分別達到54.0%和74.8%,在60 min時分別達到65.4%和90.1%,在270 min時達到了97.4%和100.0%。相同濃度的葉黃素對DPPH·的清除率略高于β-胡蘿卜素,在330 min時,0.2 mmol/L葉黃素和β-胡蘿卜素對DPPH·的清除率分別為44.8%和41.1%,0.5 mmol/L的葉黃素和β-胡蘿卜素對DPPH·的清除率分別為67.1%和56.9%,均高于0.2 mmol/L的番茄紅素對DPPH·的清除率。

圖2 番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對DPPH·清除率隨時間的變化

圖3為不同濃度番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素在160 min時的DPPH·清除率,DPPH·清除率隨著類胡蘿卜素濃度的增大而增大,其中番茄紅素對DPPH·的清除率最大。濃度為0.1 mmol/L的番茄紅素對DPPH的清除率達到78.3%,濃度為0.1 mmol/L的β-胡蘿卜素對DPPH·的清除率僅為30.1%,略高于0.1 mmol/L的葉黃素對DPPH·的清除率(25.2%)。但隨著濃度的增大,葉黃素對DPPH·的清除率逐漸高于β-胡蘿卜素,濃度達到0.6 mmol/L時,番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對DPPH·的清除率分別為95.4%、76.7%和47.7%。這是由于共軛雙鍵數越多自由基清除能力越強,番茄紅素共軛雙鍵數為13個,大于葉黃素和β-胡蘿卜素,而雖然葉黃素與β-胡蘿卜素共軛雙鍵數均為10個,但葉黃素端環上的羥基提高了類胡蘿卜素自由基清除活性[29]。

圖3 不同濃度番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對DPPH·的清除率(160 min)

利用UV-Vis法同樣進行了DPPH·清除率測定。實驗證明,三種類胡蘿卜素自身在517 nm處均有不同程度的吸收(圖4)。當作用時間為30 min時,扣除溶劑空白和類胡蘿卜素自身吸收后,番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對DPPH·的清除率分別為48.15%、17.83%和10.23%,與EPR等比例濃度測試結果(74.85%、18.49%、8.71%,見圖2)相比,兩種方法測得的三種類胡蘿卜素抗氧化能力具有較高的相關性,但清除率有所差別,尤其是番茄紅素。這可能是由于番茄紅素在517 nm處有較強吸收,與DPPH光譜特征峰最大吸收嚴重重疊造成,即使進行了人為背景扣除,仍會對測試結果造成較大干擾。

圖4 番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素和DPPH的UV-Vis吸收光譜

2.2 番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素對·OH清除率

采用Fenton法產生·OH(Fe2++2H2O2=Fe3++2·OH+2H2O),Fe2+和H2O2比例不同會影響反應過程,產生的·OH量也不同。由于·OH是一種短壽命的氧自由基,在水溶液中壽命只有10-9s,不能直接在室溫檢測得到EPR信號,必須加入自由基捕獲劑與其形成比較穩定的自由基加合物。DMPO是一種常用的羥基自由基捕獲劑,與·OH結合后會生成DMPO-OH加和物,其EPR譜顯示出強度比為1∶2∶2∶1的四線譜。圖5是用DMPO作為自由基捕獲劑得到的不同比例的Fe2+和H2O2反應后DMPO-OH的EPR譜圖和信號強度圖。在Fe2+濃度一定時,隨著Fe2+∶H2O2比例的減小(即H2O2濃度的增大),DMPO-OH信號強度呈先增大后基本不變的趨勢,因此本文羥基自由基清除實驗所選用Fe2+∶H2O2濃度比為1∶10。

圖5 不同比例的Fe2+和H2O2反應后DMPO-OH的EPR譜圖(A)和信號強度圖(B)

實驗同時發現,當Fe2+∶H2O2比例固定時,DMPO-OH的信號強度會隨Fe2+和H2O2濃度的增大而增加。以DMPO-OH第二條峰峰值強度對Fe2+濃度(Fe2+∶H2O2=1∶10)進行曲線擬合,結果如圖6所示。由圖可知,Fe2+濃度在0.05～0.30 mmol/L范圍內與DMPO-OH強度呈良好的線性關系,線性方程I=8510.86C+321.27,相關系數R2=0.9914。說明Fe2+:H2O2比例固定時,Fe2+濃度與DMPO-OH信號強度成正比,即產生的·OH濃度與DMPO-OH信號強度呈正比,通過測定類胡蘿卜素加入前后DMPO-OH強度變化,可用于計算·OH的清除率。實驗時,固定Fe2+濃度為0.25 mmol/L用于類胡蘿卜素對·OH清除率的測定。通過DMPO捕獲劑捕獲到的自由基加合物雖然比原有的·OH穩定,但也會在短時間內發生明顯衰減(圖7),對·OH清除率測定造成影響,因此實驗加入DMPO捕獲劑后需在5 min內完成EPR的檢測。

圖6 DMPO-OH強度與Fe2+濃度關系曲線(Fe2+∶H2O2=1∶10)

圖7 DMPO-OH強度隨時間變化曲線

圖8為不同濃度番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素在5 min時的·OH清除率,由圖8可知,·OH清除率隨著類胡蘿卜素濃度的增大而增大。低濃度時,葉黃素對羥基自由基清除能力最強,β-胡蘿卜素次之,番茄紅素最弱。濃度為0.1 mmol/L的葉黃素、β-胡蘿卜素和番茄紅素對·OH的清除率分別為13.1%、5.7%和3.7%。隨著濃度的增大,番茄紅素對·OH的清除能力顯著增強,而葉黃素和β-胡蘿卜素的清除能力增強較緩,濃度高于0.3 mmol/L時,三種類胡蘿卜素對·OH的清除能力為:番茄紅素>葉黃素>β-胡蘿卜素。濃度為0.6 mmol/L的番茄紅素對·OH的清除率達到56.6%,而相同濃度的葉黃素和β-胡蘿卜素對·OH的清除率分別僅為29.1%和14.0%。此結果與劉科梅[29]利用UV-Vis法所測三種類胡蘿卜素對·OH的清除能力趨勢一致。類似的,對于·OH而言,其本身沒有顏色特征峰,采用UV-Vis法檢測時均需另加顯色劑(如水楊酸鈉,與·OH反應生成紫色產物,在510 nm波長處有最大吸收)[29-30],因此,類胡蘿卜素自身的光譜干擾仍然會影響清除率的準確測定。

圖8 不同濃度番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對羥基自由基的清除率(5 min)

綜上,三種類胡蘿卜素對DPPH·和·OH均有一定的清除能力,在類胡蘿卜素濃度大于0.3 mmol/L時對DPPH和羥基自由基的清除率均為:番茄紅素>葉黃素>β-胡蘿卜素,說明三種類胡蘿卜素中番茄紅素的抗氧化活性最強,葉黃素次之,β-胡蘿卜素最弱。對比DPPH·與羥基自由基清除率,三種類胡蘿卜素對·OH的清除率較低,且·OH清除率測定的誤差較大,一方面是因為·OH的清除率測定是在5 min內完成的,由DPPH·不同時間清除率測定(圖2)可知,三種類胡蘿卜素對自由基的清除需要一定的時間,短時間內清除率較低;另一方面是因為類胡蘿卜素是脂溶性的,而·OH產生體系是水相的,在水相中類胡蘿卜素溶解性受到影響。與UV-Vis相比,EPR作為一種直接檢測自由基變化的技術,不受溶液顏色和濁度的影響,在對于本文三種類胡蘿卜素自由基清除能力表征方面,具有一定優勢。

3 結論

本文基于電子順磁共振波譜法測定,通過比較番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對DPPH·和·OH清除能力的大小,研究了三種類胡蘿卜素抗氧化活性能力。結果表明:兩種自由基在一定濃度范圍內與其EPR信號強度呈良好的線性關系,適合用于清除率測定。三種類胡蘿卜素對兩種自由基均有一定清除作用,且類胡蘿卜素濃度越大,自由基清除率越高,抗氧化活性越強。其中,番茄紅素的抗氧化活性能力最強,葉黃素次之,β-胡蘿卜素最弱。該研究結果可為完善類胡蘿卜素等天然食品添加劑的抗氧化能力評價方法提供依據。