HPLC法同時測定食用植物酵素中12種有機酸

王珍珍,沙如意,*,王高堅,徐成龍,戴 靜,葛 青,毛建衛,2,*,朱姣琳

(1.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心,浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江杭州 310023;2.浙江工業職業技術學院,浙江紹興 312000;3.富元生命科技(寧波)有限公司,浙江寧波 315194)

食用植物酵素(Edible plant source Jiaosu)[1]是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料,加(或不加)糖類物質,經多種有益菌通過較長時間發酵而生產的功能性微生物發酵產品,擁有豐富的代謝產物、植物本身營養成分和益生菌等,特別是富含小分子功能成分,研究表明該類產品具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強機體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能[2-5]。

有機酸可影響食用植物酵素的口感、穩定性、pH等,具有抗菌活性、控制血糖水平和調節血脂異常[6-7],軟化血管、助于消化吸收、改善食欲等功能,發酵過程中適當的酸度不僅能起到抑菌的作用,還能增強VC、花青素、花色苷等活性成分的穩定性[8],而且通過改變pH調控微生物的代謝,可使有機酸代謝成為酚類物質或風味物質的前體物質[9]。食用植物酵素中有機酸的組成除了受原料的影響,還與菌種、代謝等因素有關,有機酸的種類及含量會直接影響食用植物酵素產品的口感、風味和品質。用于定量評價發酵產品如發酵果蔬汁、酒類、醋類等中的有機酸含量主要方法有:液相色譜法、氣相色譜法和毛細管電泳法等,其中液相色譜(HPLC)操作簡便、精密度高,因而成為最廣泛的鑒定發酵產品中有機酸的方法[10-11]。

本文采用HPLC法建立同時檢測食用植物酵素中12種有機酸含量的方法,以此檢測了5種食用植物酵素中有機酸的含量,并以12種有機酸含量為變量進行主成分分析和分層聚類熱圖分析,實現了對不同原料植物酵素中有機酸代謝產物的區分,以期為食用植物酵素發酵過程監測及品質控制提供方法學指導,同時為不同原料植物酵素發酵過程中有機酸代謝產物差異監測提供科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青梅酵素、沙棘酵素、火龍果酵素 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室;博伊森莓酵素(由博伊森莓、菠蘿、橙子發酵制備)、黃金酵素(由菠蘿、橘子、葡萄發酵制備) 富元生命科技(寧波)有限公司;草酸、富馬酸(98%)、馬來酸(99.7%)、蘋果酸(98%)、檸檬酸(均為標準品) 中國藥品生物制品檢定所;酒石酸(色譜純) Sigma公司;抗壞血酸、莽草酸、沒食子酸、乙酸、乳酸、磷酸二氫鉀(色譜純) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(色譜純) 美國天地有限公司;磷酸(色譜純) 上海長哲生物科技有限公司。

Allegra X-12R型冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;Waters e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 配制0.01 mol/L KH2PO4溶液,用磷酸調pH至2.7,用于稀釋樣品和配制標準溶液。取適量樣品,10000 r/min高速離心10 min,取上清液,適當稀釋后過0.22 μm的微孔濾膜,用于有機酸分析。

1.2.2 有機酸混合標準溶液的配制 精確稱取各有機酸,配制草酸、酒石酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、沒食子酸的混合標準溶液,其濃度分別為0.095、1.000、1.000、0.009、0.100、1.00、1.069、0.0096、1.000、0.0108、1.000、0.0098 mg/mL,分別將其不稀釋,稀釋20倍、10倍、5倍、4倍,得到不同溶度的標準混合液,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 HPLC分離條件優化 色譜柱:AtlantisRR T3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:A:甲醇,B:KH2PO4,用磷酸調pH至2.7;流速:1 mL/min,等度洗脫,檢測器:光電二極管陣列檢測器,進樣量:10 μL。通過對標準品的波長掃描,確定檢測波長,3D分辨率設置為1.2 nm;通過改變緩沖鹽濃度(以0.01、0.02、0.04 mol/L KH2PO4等不同濃度的緩沖溶液為水相,流動相A∶B=2∶98,柱溫20 ℃),流動相比例(以0.01 mol/L KH2PO4緩沖溶液為水相,流動相分別為A∶B=1∶99、2∶98、3∶97、4∶96,柱溫20 ℃),柱溫(以0.01 mol/L KH2PO4緩沖溶液為水相,流動相A∶B=2∶98,柱溫分別為20、25和30 ℃),優化HPLC分離條件。

1.2.4 方法學考察實驗 通過線性關系、檢出限、加標回收率、精密度等考察方法的可行性。

1.2.5 主成分分析和分層聚類熱圖分析 通過主成分分析的思想,對多維數據進行降維處理,以實現利用較少的變量表達原來多重復雜變量信息的目的。以12種有機酸為變量,5種食用植物酵素樣品作為研究對象,基于R軟件(R x64 3.6.2)對數據進行主成分分析和分層聚類熱圖分析。

1.3 數據處理

使用Origin 8.6軟件和Waters e2695自帶的Empower 3軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 HPLC分離條件優化

2.1.1 檢測波長的確定 用光電二極管陣列檢測器,檢測器在190～400 nm范圍內分別對12種有機酸進行波長掃描。結果表明,各有機酸的最大吸收波長分別為:莽草酸:212.4 nm;乙酸:201.8 nm;馬來酸:210.0 nm;富馬酸:208.9 nm;沒食子酸:214.7 nm;草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸均在210 nm附近有較大吸收。綜上,選擇210 nm作為有機酸的檢測波長。

2.1.2 緩沖鹽濃度的選擇 有機酸為弱酸,在水溶液中存在著解離平衡,向流動相中加入磷酸鹽,提高H+濃度,有利于有機酸保持分子態,增加其在色譜柱上的保留時間[12]。各條件下分離效果見圖1。從圖1中可以看出,各有機酸均能有效分離,分離度較好,峰型較好,KH2PO4緩沖溶液濃度的改變對各有機酸的分離效果影響不大,考慮到高鹽度對泵和色譜柱的影響,采用0.01 mol/L KH2PO4作為流動相緩沖液,這與Scherer等的研究結果一致[13]。

圖1 流動相中不同濃度KH2PO4緩沖液條件下有機酸混合標準品色譜圖

2.1.3 流動相中甲醇比例的選擇 增加流動相中甲醇的比例,有機酸疏水基與固定相的相互作用減弱,保留時間縮短,能有效改善峰形[14]。流動相中甲醇的比例對有機酸分離效果的影響見圖2,由圖2可知:隨著流動相中甲醇含量的增加,分析時間縮短。當流動相中甲醇含量為1%時,抗壞血酸與乳酸有部分色譜峰重疊;甲醇含量為2%,各有機酸可有效分離;甲醇含量為3%時,莽草酸與抗壞血酸色譜峰有小部分重疊;當甲醇含量為4%時,蘋果酸、莽草酸與抗壞血酸的色譜峰有部分重疊,富馬酸和琥珀酸的色譜峰重疊,不能分離。綜上所述,確定流動相中甲醇的比例為2%。

圖2 流動相中不同濃度甲醇條件下混合有機酸標準品色譜圖

2.1.4 柱溫的選擇 溫度升高,可降低傳質阻力,縮短分離時間。不同柱溫下,有機酸的分離效果見圖3。由圖3可知:25 ℃時,莽草酸與抗壞血酸的分離度降低,馬來酸與檸檬酸的分離度降低;30 ℃時,莽草酸與抗壞血酸色譜峰部分重疊,馬來酸與檸檬酸色譜峰重疊,不能有效分離,20 ℃條件下,各種有機酸分離度及峰形較好。故選擇較優的色譜柱溫度為20 ℃。

圖3 不同柱溫條件下混合有機酸標準品色譜圖

綜合上述實驗結果,確定HPLC分離有機酸的較優條件為:檢測波長210 nm,流動相甲醇:KH2PO4(0.01 mol/L,pH2.7)=2∶98 (V/V),柱溫:20 ℃。

2.2 有機酸標準曲線和檢出限

分別吸取不同濃度的12種有機酸標準溶液,在上述優化后的HPLC分離條件下采集數據并進行分析。以12種標準有機酸的峰面積(y)對各自的濃度(x)進行線性回歸分析,所得各種有機酸的標準曲線和線性范圍如表1所示,決定系數為0.9994～0.9999,表明各有機酸含量與其濃度之間線性關系良好。根據信噪比確定檢出限(RSN=3),從表1可以看出,12種有機酸的檢出限在0.05～12.47 μg/mL范圍內。

表1 有機酸標準曲線及檢出限

2.3 加標回收率實驗

取青梅酵素發酵液2份,一份中加入有機酸標準品,平行測定3次,計算相應的加標回收率和相對標準偏差(RSD),結果見表2,各有機酸的加標回收率在87.28%～109.78%之間,回收率較好,而且各種有機酸的相對標準偏差RSD的范圍在0.11%～4.19%之間,說明本方法具有較好的靈敏度和重復性。

表2 樣品加標回收率

2.4 精密度實驗

取有機酸標準溶液,連續進樣6次,測定各組分的含量,計算精密度,結果見表3,該方法的精密度RSD(%)在0.49%～1.49%之間。

表3 方法的精密度

2.5 5種食用植物酵素中有機酸含量測定

采用上述優化后的液相色譜條件,對不同原料制備的青梅酵素、沙棘酵素、火龍果酵素、博伊森莓酵素和黃金酵素5種食用植物酵素中有機酸的種類及含量進行檢測,所得色譜圖峰型均較好,分離度均較高,有機酸測定結果見表4。

表4 5種食用植物酵素中有機酸含量測定結果

食用植物酵素中的有機酸除了源于原料本身外,還可以通過微生物的代謝途徑產生。從表4中可以看出,5種食用植物酵素中均檢測到酒石酸、乙酸和檸檬酸。青梅酵素中檢測到10種有機酸,其中蘋果酸、檸檬酸的含量較高,乙酸次之;研究表明:青梅原料中含有草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸和琥珀酸,其中檸檬酸的含量最高,其次是蘋果酸,馬來酸的含量極低[15-16];本研究在青梅酵素中也檢測到草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸,除此之外還檢測到了少量的莽草酸和富馬酸。莽草酸作為芳香氨基酸等的前體,在經莽草酸途徑合成的同時,也會進入其他代謝途徑;富馬酸是微生物進行三羧酸循環的中間產物,生成的同時也會通過其它途徑進行分解代謝,因此在青梅酵素中莽草酸和富馬酸的含量較低。本研究從青梅酵素中未檢測到馬來酸,可能是因為馬來酸在青梅酵素發酵的微生物代謝過程中不容易積累。

沙棘酵素中檢測到11種有機酸,其中蘋果酸的含量最高,其次是酒石酸、乙酸和抗壞血酸,草酸和檸檬酸的含量較低。研究表明:沙棘原料中含有草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、抗壞血酸和乳酸,其中蘋果酸含量最高[17-18]。本研究在沙棘酵素中還檢測到莽草酸、乙酸、馬來酸、富馬酸和沒食子酸,未檢測到乳酸。沙棘酵素中檢測到沒食子酸的含量為0.003 mg/mL,孫燕[18]采用高效液相色譜-高分辨質譜法從沙棘葉和莖中檢測到沒食子酸,但是在沙棘果中沒有檢測到沒食子酸;沙棘酵素中的沒食子酸可能是由莽草酸途徑生成的3-脫氫莽草酸,在莽草酸脫氫酶或脫氫莽草酸脫氫酶作用下生成[19]。

火龍果酵素中檢測到9種有機酸,其中乳酸含量最高,其次是乙酸。蔣儂輝等[20]從火龍果原料中檢測到草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、抗壞血酸8種有機酸,其中蘋果酸的含量最高,其次是檸檬酸。本研究從火龍果酵素中除檢測到上述7種有機酸(無抗壞血酸)外,還檢測到莽草酸和富馬酸。

博伊森莓酵素由博伊森莓、菠蘿和橙子3種水果發酵而成,本研究從博伊森莓酵素中檢測到10種有機酸:草酸、酒石酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和沒食子酸,其中檸檬酸的含量最高,其次是琥珀酸,蘋果酸、乙酸、乳酸次之。研究表明:3種水果原料中含有檸檬酸、琥珀酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、乳酸、草酸8種有機酸[21-25]。對比原料中的有機酸種類,發酵過程中新產生了莽草酸、乳酸、乙酸、富馬酸和沒食子酸。

黃金酵素由菠蘿、橘子和葡萄3種水果發酵而成,本研究從黃金酵素中檢測到酒石酸、乳酸、乙酸和檸檬酸,但4種有機酸的含量相對較低。研究表明:3種水果原料中含有蘋果酸、檸檬酸、草酸、莽草酸、酒石酸和乳酸6種有機酸[26-28],對比原料中的有機酸種類,發酵過程中丙酮酸、蘋果酸、富馬酸等有機酸可能在發酵過程中轉化成其他代謝物。

2.6 5種食用植物酵素中有機酸代謝產物的主成分分析

各種有機酸賦予了酵素不同的風味特性,蘋果酸具有溫和愉悅性的酸味,檸檬酸具有溫和的酸味,乙酸具有刺激性酸味,乳酸酸味溫和適中,琥珀酸有鮮味。不同原料制備的植物酵素中有機酸的種類及含量有較大差異,因而不同原料制備的食用植物酵素表現出不同的風味特征。為了明確不同種類有機酸的差異對于酵素風味特征的影響,以5種食用植物酵素為研究對象,以12種有機酸作為研究變量,利用R語言對所得的有機酸含量進行主成分分析,選取特征值大于1的成分為主成分,結果如圖4所示,前2個主成分的方差貢獻率分別為42.48%和34.52%,累計方差貢獻率達到77.00%,表明前2個主成分能夠較好地代表5種食用植物酵素中總有機酸77.00%的信息。其中,變量蘋果酸、檸檬酸在第一主成分的正方向有較高的載荷系數,說明與第一主成分正相關;變量草酸、酒石酸、莽草酸、抗壞血酸、馬來酸、富馬酸、沒食子酸在第一主成分的負方向有較高的載荷系數,說明與第一主成分負相關;變量乙酸、乳酸在第二主成分的正方向有較高的載荷系數,說明與第二主成分正相關;變量蘋果酸在第二主成分的負方向有較高的載荷系數,說明與第二主成分負相關。因此,檸檬酸、蘋果酸和乳酸是影響食用植物酵素的主要特征有機酸成分,對不同原料制備的植物酵素差異影響較大。

圖4 不同酵素樣品的有機酸主成分分析

樣品博伊森莓酵素和青梅酵素沿第一主成分正方向分布,在第二主成分方向的投影比較短,表明檸檬酸、蘋果酸占有較高的比重,對兩種酵素的風味產生明顯影響。沙棘酵素沿第二主成分負方向分布,表明蘋果酸占有較高的比重,對于沙棘酵素的風味產生明顯影響。火龍果酵素和黃金酵素沿第二主成分正方向分布,表明乙酸和乳酸占有較高的比重,從而顯著影響兩種酵素的風味特征。這些有機酸含量的差異,賦予了不同植物酵素的特征風味差異。

2.7 5種食用植物酵素中有機酸代謝產物的聚類分析

為了進一步確定不同原料制備的植物酵素有機酸代謝產物表達的定量差異,對5種植物酵素樣品進行層次聚類分析,并繪制了樣品中有機酸代謝產物含量的熱圖,結果如圖5所示,通過歐式距離法聚類分析,把5種來源食用植物酵素分成3類,火龍果酵素和黃金酵素為一類,乳酸和乙酸含量較高;青梅酵素和沙棘酵素為一類,蘋果酸含量較高;博伊森莓酵素為一類,其中的檸檬酸和琥珀酸含量較高。對五種不同原料制備的食用植物酵素有機酸進行聚類分析,可以將有機酸分為三類,一類為OA1:草酸、酒石酸、莽草酸、乳酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、沒食子酸、馬來酸和抗壞血酸;一類為OA2:蘋果酸;另一類OA3為檸檬酸;這與圖4有機酸的主成分分析結果相一致。

圖5 不同酵素樣品的有機酸熱圖和聚類分析

3 結論

本文建立了同時檢測食用植物酵素中12種有機酸的HPLC方法,優化后的色譜條件為:檢測波長210 nm,流動相為甲醇:KH2PO4(0.01 mol/L,pH2.7)=2∶98 (V/V),柱溫20 ℃;所得各種有機酸的標準曲線決定系數為0.9994～0.9999,加標回收率為87.28%～109.78%之間,該方法的精密度RSD(%)在0.49～1.49%之間,該方法具有操作簡便、快速、準確度高、精密度高、重復性好等優點。利用此法對青梅酵素、沙棘酵素、火龍果酵素、博伊森莓酵素和黃金酵素5種食用植物酵素中的有機酸種類及含量變化進行測定,分別檢測到10、11、9、10、4種有機酸,均檢測到酒石酸、乙酸和檸檬酸。該方法適合食用植物酵素樣品中有機酸的檢測,為食用植物酵素樣品中有機酸檢測提供方法學基礎。

對5種食用植物酵素的有機酸含量進行主成分分析,提取2個主成分反映酵素中有機酸的77.00%的信息。檸檬酸、蘋果酸和乳酸是食用植物酵素主要特征有機酸成分,對不同原料來源的植物酵素差異影響較大。通過分層聚類熱圖分析,可將5種來源的食用植物酵素分成三類,其中火龍果酵素和黃金酵素為一類,乳酸和乙酸含量較高,青梅酵素和沙棘酵素為一類,蘋果酸含量較高,博伊森莓酵素為一類,檸檬酸和琥珀酸含量較高。對5種不同原料制備的食用植物酵素有機酸進行聚類分析,可以將有機酸分為三類,一類以乳酸為主,一類以蘋果酸為主,另一類以檸檬酸為主。本研究通過對不同原料制備的食用植物酵素中有機酸含量進行分析,闡明了不同原料發酵的食用植物酵素有機酸的差異,為食用植物酵素的開發利用提供數據支撐。