谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑對于犬貓臨床術(shù)前術(shù)后腸道修復(fù)、應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)的作用研究

王秀君，付運星，閻 峰，劉永華，李四豪

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.鄭州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所；3.鄭州立蓓生物工程有限公司；4.鄭州瑞派小俏皮動物醫(yī)院）

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物犬6 只，體質(zhì)量在6～8 kg 之間，貓6 只，體質(zhì)量在1.5～5 kg之間，試驗動物在疾病狀態(tài)下。

1.2 儀器及耗材

堿性磷酸磷（ALKP）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、總膽固醇（TBIL）、尿素（UREA）、肌苔（CREA）試劑盒、總蛋白（TP）試劑盒、白蛋白（ALB）試劑盒、隣（PHOS）試劑盒、葡萄糖（GLU）檢測試劑盒及總抗氧化能力試劑盒（T-AOC）均購于南京建成生物科技公司；血生化分析儀及全自動血球儀購于邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；EDTA抗凝管及離心管均購于寶生物科技有限公司；谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑為鄭州立蓓公司提供，按照5 kg體質(zhì)量以下添加2.5 g、5 kg體質(zhì)量以上添加10 g，進(jìn)行喂食。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

動物數(shù)量及分組方法:實驗動物犬共6只（A組01、02、03，B 組04、05、06）、貓共6 只（C 組07、08、09，D 組10、11、12），按照使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑的時間和次序分為下列四組（表1）。首先對A 組、C 組實驗犬貓連續(xù)服用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑7 d，然后對B組、D組實驗犬貓進(jìn)行正常喂藥。

分組疾病期是否服用谷氨酰胺與溶菌酶ABCD犬貓編號01，02，03 04，05，06 07，08，09 10，11，12復(fù)合制劑服用不服用服用不服用

1.3.2 檢測方法

所有12只實驗動物試驗前后進(jìn)行全血血常規(guī)檢查和血清學(xué)檢查，記錄血常規(guī)紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)及血小板計數(shù)，并依據(jù)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及血小板計數(shù)分別計算NLR 和PLR。用藥5 h后（記錄第0天）、使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑后第1天、第2天、第3天、第5天、第7天對犬貓采血，制備血清，對血清中ALKP（堿性磷酸酶）、ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、AST（天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、TBIL（總膽固醇）、UREA（尿素）、CREA（肌苔）、TP（總蛋白）、ALB（白蛋白）、PHOS（隣）、CA（鈣）、GLU（葡萄糖）等指標(biāo)按試劑盒說明書進(jìn)行檢查。

血清總抗氧化能力（T-AOC）檢測方法為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度（標(biāo)準(zhǔn)物由試劑盒公司提供，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8 U/ml，依次倍比稀釋為4 U/ml、2U/ml、1U/ml 和0.5 U/ml，分別為5 號標(biāo)準(zhǔn)品、4 號標(biāo)準(zhǔn)品、3 號標(biāo)準(zhǔn)品、2 號標(biāo)準(zhǔn)品和1 號標(biāo)準(zhǔn)品）為縱坐標(biāo)，OD 值為橫坐標(biāo)，根據(jù)測定的標(biāo)準(zhǔn)樣品值繪出標(biāo)準(zhǔn)T-AOC曲線，得出OD值和濃度的曲線公式，再根據(jù)公式依據(jù)樣品測出的OD值計算出樣品T-AOC的濃度，并分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床檢查

實驗動物在疾病狀態(tài)下，飲食量低，無力，糞便成型較差，部分犬貓出現(xiàn)嘔吐腹瀉現(xiàn)象，而使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑治療組病犬貓飲食量低，無力現(xiàn)象明顯恢復(fù)，嘔吐腹瀉犬貓數(shù)量大為減少。

2.2 血常規(guī)檢查

取實驗犬貓前肢靜脈血樣，經(jīng)血細(xì)胞分析和血清生化檢查分析結(jié)果顯示：經(jīng)過使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑治療組的病犬貓NLR 和PLR值顯著升高，與不服用藥物組差異顯著（表2 P＜0.05），且連續(xù)服用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑5 d，白細(xì)胞濃度最高；而谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑治療后紅細(xì)胞、血紅蛋白、MCV、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板的濃度與不服用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑藥物組差異不顯著（P＞0.05）。ALT、AST 、TBIL 、UREA、CREA、TP、ALB、PHOS、CA、GLU 與不服用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑藥物組差異不顯著（P＞0.05）。

組別動物種類例數(shù)ABCDP值犬犬貓貓6666 NLR 5.15±0.47 2.09±0.76 4.4±0.35 2.7±0.54＜0.001 PLR 243±26 115±38 198±17 124±6＜0.001

2.3 實驗動物分別于使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑、未使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑后第3天、第5天、第7天進(jìn)行血清T-AOC檢測OD結(jié)果

依據(jù)試劑盒操作步驟，繪制T-AOC 檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），完成樣品的OD 值檢測，將所檢測出的OD 值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線，計算出相對應(yīng)的血清中T-AOC 濃度值，將第3 天、第5 天、第7 天的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，如表2,表3和表4所示。

組別（5 d）ABCD A1 0.011 0.583582 0.031139 B-1 0.008261 0.006389 C--1 0.07172 D---1

組別（7 d）ABCD A1 0.004359 0.011263 0.28402 B-1 0.000291 0.003336 C--1 0.156177 D---1

組別（14 d）ABCD A1 0.000429 0.026649 0.385171 B-1 0.000276 0.000127 C--1 0.138905 D---1

實驗中，A 組濃度曲線在0～7 d 維持在高水平，直至穩(wěn)定;C 組曲線先高后低，之后保持穩(wěn)定，機(jī)體在造模后的0～3 d，T-AOC 濃度逐漸升高，對于機(jī)體在肝損傷初期起到很好的保護(hù)作用，當(dāng)3～14 d之后慢慢下降趨于穩(wěn)定，是機(jī)體穩(wěn)定之后的表現(xiàn)；D 組曲線先低后高，之后保持穩(wěn)定，機(jī)體在造模初期0～5 d 抗氧化能力降低，在5～14 d 機(jī)體抗氧化能力逐漸升高且趨于穩(wěn)定；B組曲線呈一直下降趨勢，機(jī)體損傷嚴(yán)重，抗氧化水平持續(xù)降低。

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：T-AOC濃度變化在3 d后各組出現(xiàn)差異，在生物統(tǒng)計上，造模后5 d，A組與B組和D組差異顯著（P＜0.05），B組與C組和D組差異極顯著（P＜0.01）；造模后7 d，A 組與B 組差異極顯著（P＜0.01），和D 組差異顯著（P＜0.05），B組與C組和D組差異極顯著（P＜0.01）；造模后14 d，A組與B組差異極顯著（P＜0.01），和C組差異顯著（P＜0.05），B組與C組和D組差異極顯著（P＜0.01）。

2.4 結(jié)果分析

A組、C組分析：因為使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑組犬貓其T-AOC在一周左右升高至穩(wěn)定水平，表明A組、D 組保持機(jī)體高的總抗氧化能力，并在5 d、7 d 與A 組、C組差異極顯著（P＜0.01），表明谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑能提高機(jī)體抗氧化能力，修復(fù)腸黏膜。

B組、D組分析：有使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑，T-AOC在3 d左右上升緩慢，機(jī)體總抗氧化能力恢復(fù)弱。

3 討論

血常規(guī)是臨床常用的生化化驗檢查之一，具有經(jīng)濟(jì)、便捷等優(yōu)點，白細(xì)胞計數(shù)對機(jī)體急慢性炎癥反應(yīng)的敏感性較高，但特異性較差。多項研究表明，NLR 和PLR 可以有效反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。炎癥反應(yīng)時，淋巴細(xì)胞減少，中性粒細(xì)胞呈上升趨勢，NLR 可同時反映兩者的變化。NLR和PLR在腫瘤和心血管疾病患者預(yù)后評估中具有良好的應(yīng)用價值，并與多種自身免疫性疾病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等）的活動相關(guān)。

該研究對患犬貓服用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑后檢測外周血PLR、NLR指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過使用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑治療組的病犬貓NLR 和PLR值顯著升高，與不服用藥物組差異顯著，表明谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑在治療犬貓相關(guān)類疾病時可以通過上調(diào)病犬貓的PLR 和NLR 進(jìn)而發(fā)揮治療性作用。

血清中T-AOC的含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出組織、細(xì)胞損傷的程度。實驗犬貓的進(jìn)食量及精神狀態(tài)反映出谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑對機(jī)體能力的恢復(fù)表現(xiàn)，在該試驗中，試驗犬在服用谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑后，從第3天開始，其血清T-AOC開始提升至正常值，表明受損細(xì)胞在恢復(fù)，而在使用后期，亦呈此趨勢，說明谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)肝臟藥物代謝酶代謝后產(chǎn)生了自由基，引起白細(xì)胞值下降，血清T-AOC趨于正常值。

谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑中含有的有效成分是谷氨酰胺、溶菌酶，有試驗結(jié)果表明，谷氨酰胺與溶菌酶復(fù)合制劑可以通過降低機(jī)體T-AOC的含量能夠改善全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）的程度及預(yù)后，還可改善腸黏膜屏障通透性，并可以使患犬生存率提高，參與機(jī)體多種免疫反應(yīng)，在機(jī)體正常防御功能和非特異性免疫中，具有保持機(jī)體生理平衡的重要作用。