施用有機(jī)肥對(duì)生菜和土壤中可培養(yǎng)抗生素耐藥菌的影響

李會(huì)賢,趙 晶,姚春霞,黃柳娟,馮 博,王 華,王衛(wèi)國(guó),邵 毅?

(1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306;2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,上海201403;3華東師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,上海200241;4 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201403;5美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)系,哥倫布43210;6復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200433;7上海國(guó)榮果業(yè)專業(yè)合作社,上海201516)

抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的過(guò)量應(yīng)用易引發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性(AR),會(huì)對(duì)環(huán)境和食品的安全造成嚴(yán)重影響。除了動(dòng)物源性農(nóng)產(chǎn)品,研究人員在蔬果產(chǎn)品中也發(fā)現(xiàn)了耐藥菌(ART)[1-2],但其污染來(lái)源尚不明確。 栽培要素中的土壤[3-4]、灌溉水[5]、糞肥[6]∕有機(jī)肥[7]、甚至空氣[8]中富含的ART 菌和AR基因,都是蔬果表面ART 菌的潛在來(lái)源;此外,土壤中的抗生素殘留也有可能對(duì)蔬菜內(nèi)生菌造成耐藥壓力[9]。 揭示種植過(guò)程中各栽培要素及種植操作對(duì)蔬果產(chǎn)品,特別是對(duì)即食蔬果產(chǎn)品中ART 菌的影響,是保證其微生物安全性的基礎(chǔ)。

目前,有關(guān)農(nóng)產(chǎn)品中ART 菌的研究主要集中在致病菌的耐藥性篩查和耐藥機(jī)制等方面[10-11]。 但致病菌僅占整個(gè)細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)中的很小一部分,且諸多證據(jù)表明,多種非致病菌均可成為AR基因的供體、受體及中間體,對(duì)AR基因的水平遷移擴(kuò)散具有重要作用[12]。 目前,已在蔬果中發(fā)現(xiàn)了大量的AR基因移動(dòng)原件[13],表明蔬果中AR基因水平遷移現(xiàn)象的存在。 因此,亟需在整個(gè)細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)范圍內(nèi)展開(kāi)研究,以揭示不同栽培要素和操作對(duì)蔬果產(chǎn)品中的ART 菌發(fā)生的影響。 本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn),探究單次施用有機(jī)肥對(duì)采摘期生菜及其栽培土壤中7 類ART 菌數(shù)量以及8 種AR基因存在情況的影響,為揭示鮮食生菜表面耐藥菌的污染來(lái)源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

1.1.1 生菜栽培、施肥處理及采樣

生菜栽培試驗(yàn)在上海普南園藝場(chǎng)進(jìn)行,周邊無(wú)大型養(yǎng)殖場(chǎng)。 盆栽試驗(yàn)共設(shè)2 個(gè)處理組,分別為未施用有機(jī)肥組(CK)和施用有機(jī)肥組(OMT,Organic manure treated)。 在50 cm(長(zhǎng)) × 20 cm(寬) × 20 cm(深)的塑料盆中裝4∕5 盆土(5 kg),OMT 組在土壤表面施加當(dāng)?shù)剞r(nóng)資店購(gòu)買(mǎi)的商品化雞糞肥200 g(有機(jī)肥與土壤的質(zhì)量比為1∶25),一次性施入并混勻。 大小及葉片數(shù)量均一致的生菜苗于施肥當(dāng)天移植入塑料盆中,苗間距一致,每盆8 棵,每組3 盆。 栽培期間用自來(lái)水作為灌溉水源。 栽培0 d、30 d 和45 d 后從每個(gè)盆中隨機(jī)采集干凈的生菜葉和根層(土壤表層3—4 cm)土壤樣品,于冰盒中存放,并于當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行耐藥菌的分離。

1.1.2 市售生菜及處理

市售生菜產(chǎn)品購(gòu)自上海市大型菜場(chǎng),采后于冰盒中存放,2 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,清洗10 min 或浸泡30 min后篩查耐藥菌。

1.2 儀器與試劑

1300 SERIES A2 型生物安全柜,美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;SX-500 型高壓滅菌鍋,日本TOMY公司;BAGMIXER400 型勻漿機(jī),法國(guó)Interscience 公司;Medcenter Einrichtungen GmbH 型恒溫培養(yǎng)箱,德國(guó)Friocell 公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀和核酸電泳系統(tǒng),美國(guó)Bio-rad 公司;全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng),上海復(fù)日科技有限公司。

抗生素粉末四環(huán)素(Tetracycline,TET)、強(qiáng)力霉素(Doxycycline,DOX)、磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole,SUL)和三甲氧芐氨嘧啶(Trimethoprim,TRI)、頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、紅霉素(Erythromycin,ERM)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)、萘啶酸(Nalidixic acid, NDA) 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司; 放線菌酮(Cycloheximide,CYC)購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司;腦心浸液肉湯(Brain heart infusion,BHI)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid 公司; PCR 試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR 引物[14]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 可培養(yǎng)耐藥菌的篩查和計(jì)數(shù)

10 g 土壤、生菜或雞糞肥樣品分別與90 mL 0.9%的生理鹽水裝入無(wú)菌袋中,用勻漿機(jī)拍打10 min,10 倍梯度依次稀釋,每個(gè)濃度梯度分別取200 μL 懸濁液均勻涂布于含有16 μg∕mL TET、16 μg∕mL DOX、152 μg∕mL SUL 和8 μg∕mL TRI、4 μg∕mL CTX、100 μg∕mL ERM、4 μg∕mL CIP 或8 μg∕mL NDA 的BHI 培養(yǎng)基平板上[15]。 每個(gè)培養(yǎng)基平板內(nèi)均含有100 μg∕mL CYC 以抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)。 平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行可培養(yǎng)耐藥菌的菌落計(jì)數(shù)。 樣品均質(zhì)液梯度稀釋后涂布于不含抗生素僅含CYC 的BHI 平板中,30 ℃培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行可培養(yǎng)總菌的菌落計(jì)數(shù)。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.2 耐藥基因的篩查

根據(jù)菌落形態(tài),在每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)挑取至少25 株具有四環(huán)素耐藥表型或磺胺耐藥表型的細(xì)菌,用PCR 法篩查8 個(gè)耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetG、tetL、tetM、sul1、sul2 和一類整合酶基因intI[14]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

生菜、土壤和有機(jī)肥中ART 菌的計(jì)數(shù)結(jié)果及耐藥菌占總菌的比例用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示。 用SPSS 16.0 軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)方法比較處理組與對(duì)照組中耐藥菌占總菌的百分比的差異顯著性,當(dāng)P＜0.05 時(shí),差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售生菜中可培養(yǎng)耐藥菌的計(jì)數(shù)

市售生菜表面普遍存在耐藥菌,除未發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力霉素耐藥菌(DOXr)外,對(duì)本研究涉及的幾種抗生素耐藥的細(xì)菌均有不同程度檢出,甚至在清洗10 min 或浸泡30 min 后的生菜中仍檢出一定水平具有耐藥表型的細(xì)菌(表1)。

表1 市售生菜中可培養(yǎng)總菌和耐藥菌數(shù)量Table 1 Counts of cultivable total bacteria and ART bacteria in lettuce samples from markets

2.2 有機(jī)肥、土壤與生菜苗中可培養(yǎng)耐藥菌的本底水平

雞糞肥中能檢出7 種耐藥菌,其計(jì)數(shù)均高于106CFU∕g,比土壤和生菜苗中可培養(yǎng)耐藥菌的本底水平高1—6 個(gè)數(shù)量級(jí)。 有機(jī)肥中除CTXr和SULr外,其余耐藥菌占總菌比例均高于土壤。 土壤和生菜苗中均未發(fā)現(xiàn)DOXr,土壤中其他耐藥菌的數(shù)量和占總菌的比例均高于生菜苗,且耐藥菌的數(shù)量高于生菜苗0—1 個(gè)數(shù)量級(jí)(表2)。 比較有機(jī)肥、土壤與生菜苗中耐藥菌的本底水平,推測(cè)富含大量耐藥菌的有機(jī)肥通過(guò)直接接觸這一途徑將更多的耐藥菌引入土壤環(huán)境,進(jìn)而在栽培過(guò)程中污染生菜產(chǎn)品。

表2 雞糞肥、土壤和生菜苗中可培養(yǎng)耐藥菌本底水平及占可培養(yǎng)總菌的比例Table 2 Background levels and percentages of cultivable antibiotic-resistant bacteria in chicken manure,soil and lettuce samples

2.3 單次施用有機(jī)肥對(duì)生菜和土壤中可培養(yǎng)耐藥菌數(shù)量的影響

生菜栽培至第30 天和第45 天,其表面CTXr,SULr,NDAr,CIPr,ERMr5 類耐藥菌占總菌的百分比均顯著高于未施肥組,達(dá)7.88%—100.00%,是對(duì)照組的1.15—10.43 倍;TETr和DOXr僅在栽培45 d 樣品中檢出,其中TETr在對(duì)照組和處理組中分別占總菌的0.01%和2.47%,DOXr僅在處理組中發(fā)現(xiàn),占總菌的2.35%[圖1(a)]。 因此,不論是耐藥菌的種類還是數(shù)量,施肥組的生菜均高于對(duì)照組,說(shuō)明單次施用有機(jī)肥會(huì)提高生菜表面ART 菌的污染水平。 同時(shí),比較未處理組采摘期與0 d 生菜樣品表面的ART 菌(表2),發(fā)現(xiàn)除SULr、TETr和DOXr外,其他4 類ART 菌占總菌的比例均顯著升高,說(shuō)明除了施肥處理外還有其他因素會(huì)導(dǎo)致生菜表面ART 菌的累積。

栽培30 d 和45 d 時(shí),施肥組土壤中可培養(yǎng)耐藥菌占總菌的百分比較CK 組有所增加,增加倍數(shù)因耐藥菌種類不同而不同:30 d 時(shí),TETr、CIPr、NDAr、ERMr和SULr5 種耐藥菌占總菌的百分比提高至對(duì)照組的5.52 倍、3.98 倍、1.43 倍、1.27 倍、1.2 倍,45 d 時(shí)提高至對(duì)照組的513.74 倍、15.63 倍、2.35 倍、22.21 倍、2.15 倍;30 d 時(shí),對(duì)照組和施肥組的CTXr占總菌的百分比并無(wú)差異,而到45 d 時(shí),施肥組中CTXr的百分比略高于不施肥組,是其1.27 倍;30 d 時(shí),兩組土壤中均未檢出DOXr,但在45 d 施肥組中檢出,為1.66 ×102CFU∕g,占總菌的0.48%[圖1(b)]。

2.4 單次施用有機(jī)肥對(duì)生菜和土壤中耐藥基因的影響

為了在分子水平進(jìn)一步確認(rèn)單次施用有機(jī)肥對(duì)生菜表面和土壤細(xì)菌耐藥性的影響,在隨機(jī)選取的具有耐藥表型細(xì)菌菌落中篩查了6 個(gè)tet基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetL和tetM)、2 個(gè)sul基因(sul1 和sul2)和指示基因水平遷移潛勢(shì)的一類整合酶基因intI的存在情況。 結(jié)果表明,有機(jī)肥處理組的采摘期生菜和土壤中3 類基因的檢出率均高于對(duì)照組(圖2),表明單次施用有機(jī)肥可增加生菜及其栽培土壤中細(xì)菌的耐藥性和AR基因水平遷移的潛勢(shì);苗期生菜未發(fā)現(xiàn)3 類耐藥相關(guān)基因,可能與其四環(huán)素和磺胺耐藥水平較低(表2),獲得的用于基因檢測(cè)的菌落數(shù)(4 個(gè))較少有關(guān);土壤菌落樣品中未檢出tetA,生菜表面菌落樣品中未檢出tetC和tetM,與已有報(bào)道[16]有所不同,可能與所施用的有機(jī)肥中AR基因組成不同有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

已有研究證實(shí),施用發(fā)酵有機(jī)肥會(huì)增加土壤中AR基因數(shù)量[17],施肥可能是耐藥微生物及AR基因進(jìn)入土壤環(huán)境的主要途徑[18]。 本研究結(jié)果表明,處于采摘期的生菜(栽培30 d 或45 d)表面存在大量ART菌,且有機(jī)肥施用組的土壤和生菜中篩查到的ART 菌種類和水平以及AR基因的檢出率均高于對(duì)照組,說(shuō)明單次施用有機(jī)肥不僅提高土壤耐藥菌的污染水平,還會(huì)影響生菜表面耐藥菌的數(shù)量和種類,帶來(lái)環(huán)境和食用方面的雙重風(fēng)險(xiǎn),因此應(yīng)格外重視養(yǎng)殖場(chǎng)用藥管理和糞便處理措施,以達(dá)到控制和減滅抗生素耐藥菌的目的。

研究表明,耐藥菌除了在抗生素篩選壓下被誘導(dǎo)、選擇性富集外,耐藥基因還會(huì)通過(guò)水平基因遷移(HGT)途徑進(jìn)行傳播和擴(kuò)散[12]。 本研究在生菜和土壤樣品中均發(fā)現(xiàn)了較高水平的intI基因,推測(cè)生菜表面ART 菌的富集過(guò)程中發(fā)生了HGT,但哪類細(xì)菌參與了HGT 的發(fā)生、相關(guān)AR基因是否有可能遷移至人類共生菌中等問(wèn)題值得深入研究。 此外,生菜、土壤和有機(jī)肥中ART 菌的同源性分析及AR基因和移動(dòng)元件的遷移潛勢(shì)研究,有助于揭示有機(jī)肥施用對(duì)生菜AR 菌污染影響的分子機(jī)制。