祛濕通絡方對肺炎支原體感染的RAW264.7細胞 TNF-α、IL-6表達的影響*

李 娜 ，于光志 ，張葆青 ，王 曉

（1.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，濟寧 272029；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院兒科，濟南 250014）

肺炎支原體肺炎（MPP）是兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見類型之一，部分患兒在經過正規(guī)大環(huán)內酯類抗生素治療1周或以上，仍見持續(xù)發(fā)熱、臨床癥狀或影像學表現加重，稱為難治性肺炎支原體肺炎（RMPP）[1-2]。RMPP與MPP相比，具有對常規(guī)大環(huán)內酯類抗生素治療效果差、病情進展快、易產生嚴重并發(fā)癥等特點，嚴重危害患兒健康。

目前RMPP的發(fā)病機制尚不完全明確，可能與大環(huán)內酯類抗生素耐藥、免疫應答失調、合并感染、過度的炎癥反應及治療延遲等有關[3]。西醫(yī)對于RMPP的治療主要為在常規(guī)阿奇霉素治療基礎上加用糖皮質激素和免疫球蛋白，但目前尚無規(guī)范的療程與劑量，且無法確立其獨立療效，并有導致免疫抑制等風險。近年來，中醫(yī)藥對于MPP及RMPP的臨床研究日益深入，其中“祛濕通絡方”是導師張葆青教授根據多年臨床經驗，以“甘露消毒丹”為主方化裁而成的經驗方，臨床取得了良好的治療效果。因此，本研究對于RMPP的發(fā)病機制及祛濕通絡方對本病的作用機制進行初步探索。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，體質量200～220 g，雄性，健康，清潔級，購買于山東百朋生物科技有限公司，動物合格證編號：SCXK（魯）20140007。實驗動物飼養(yǎng)于山東省疾病預防控制中心SPF級的動物房中，環(huán)境溫度18～22℃，濕度40%～70%，自然光線照射，給予普通飼料喂養(yǎng)，自由進食及飲水，避免噪音及其他干擾。大鼠飼料及墊料由山東魯抗集團提供。適應性喂養(yǎng)1周，每日上午電子秤稱取質量，記錄每只大鼠體質量。活動、二便等均未見異常即進行實驗。

1.2 細胞株及菌株 RAW264.7細胞株，購自中國科學院上海生命科學研究院。MP標準菌株（ATCC-15531），購自上海寶錄生物科技有限公司。

1.3 實驗藥物 祛濕通絡方：江陰天江中藥免煎顆粒，購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，組成：黃芩12 g（批號：1706015），黃連 6 g（批號：18050571），虎杖12 g（批號：18071221），藿香 12 g（批號：18032561），桃仁 9 g（批號：1702029），茵陳 15 g（批號：18071081），蘆根 30 g（批號：17121121），石菖蒲 12 g（批號：18041591），甘草 6 g（批號：1802009）。阿奇霉素分散片（君潔）：魯南貝特制藥有限公司，批號：38180501，0.25 g/片。

1.4 試劑 南美特級胎牛血清（LONSERA S711-001S），1 M HePes（Solarbio H1095-100，100 mL），臺盼藍染色液（0.4%，Solarbio C0040-50，50 mL），苯酚紅（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20171026），二甲基亞砜（DMSO，Solarbio D8371-50，50 mL，批號：1213C0340），支原體肉湯（PPLO肉湯，海博HB8475，批號：20170427），支原體瓊脂培養(yǎng)基（海博HB7025-3，250 g，批號：201803028），DMEM 高糖培養(yǎng)液（Corning10-013-CVR，500mL，批號：22517004），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（華美 CSB-E04741m，96 T，批號：U07019527），白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（華美CSBE04594m，96 T，批號：U02018095）。

1.5 主要儀器 低溫冰箱Forma Model 702（美國Thermo公司），常溫、低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），Infinite M200酶標儀（瑞士Tecon公司），DMI 4000B熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司），超凈工作臺（蘇州凈化公司），二氧化碳（CO2）細胞培養(yǎng)箱（美國 Thereto fisher公司），移液器（德國Eppendorf公司），細胞計數板（Watson 177-112C）。

2 方法

2.1 RAW264.7細胞培養(yǎng) 待細胞長滿細胞瓶底部 80%時，以 1∶3傳代，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集對數增長期細胞備用。細胞存活率檢測（Trypan blue染色）：用計數板計數活細胞和死細胞（死細胞呈藍色，活細胞拒染）。計數時，只計上線與右線的細胞（或只計下線與左線的細胞）。細胞存活率＝活細胞總數/（活細胞總數＋死細胞總數）×100%。細胞存活率≥96%。

2.2 肺炎支原體（MP）培養(yǎng) 將MP菌體接種于PPLO固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基中對照培養(yǎng)，置于5% CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)1～2周。CCU濃度測定步驟：取11支無菌小試管，按1～10編號，取PPLO肉湯完全培養(yǎng)基1.8 mL分別裝入試管。取200 μL處于對數生長期的菌種加入1號試管中，依次按1∶10遞減稀釋。將所有試管加蓋硬膠塞并用封口膜封口，于5% CO2、37℃恒溫箱中培養(yǎng)，每日觀察顏色有無變化以及液體有無渾濁改變。菌液發(fā)生顏色改變的最高稀釋度為顏色改變單位（留取濃度為106～107CCU/mL的菌液備用）。

2.3 含藥血清的制備 40只SD大鼠采用隨機數字表隨機分為空白對照組、中藥（低、中、高劑量）組、阿奇霉素組。祛濕通絡方免煎顆粒濃縮至2g/mL，給藥劑量參考徐叔云《藥物試驗方法學》（第3版）：按20 kg小兒用量為中劑量折算，換算成大鼠的劑量為：人的臨床劑量×（鼠的劑量折算系數÷人的劑量折算系數）=人的臨床劑量×（0.71÷0.11），低劑量為0.5倍給藥，高劑量2倍給藥。中藥低、中、高劑量組大鼠灌胃3次/d，空白對照組和阿奇霉素組灌胃1次/d，連灌7 d，末次灌胃后1 h，均進行心尖采血。將裝有大鼠血液的促凝管靜置2 h，無菌條件下用離心機離心（離心半徑 12 cm，3 000 r/min，15 min）分離血清。用0.22 μL的濾器分裝、標記在1.5mLEP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 細胞分組及給藥 采用隨機數字表隨機設置空白對照組、模型組、中藥低、中、高劑量組和阿奇霉素組，每組設3個復孔。1）空白對照組：DMEM完全培養(yǎng)液 100 μL+空白含藥血清 100 μL。2）模型組：MP 菌液 100 μL+空白含藥血清 100 μL。3）中藥低劑量組：MP菌液100 μL+中藥低劑量含藥血清100 μL。4）中藥中劑量組：MP 菌液 100 μL+中藥中劑量含藥血清100 μL。5）中藥高劑量組：MP菌液100 μL+中藥高劑量含藥血清 100 μL。6）阿奇霉素組：MP菌液100 μL+阿奇霉素含藥血清100 μL。模型組和各給藥組分別加入MP菌液100 μL，使其最終濃度為 10 MOI（MP/細胞）細胞計數[4]，空白對照組加入等體積DMEM完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后吸出培養(yǎng)液，分別按上述要求加入含藥血清100 μL，培養(yǎng) 4、8、16、24 h 后收集細胞上清液，-80 ℃保存，備測。

2.5 TNF-α、IL-6檢測 采取ELISA方法檢測，操作按試劑盒說明書進行。

2.6 統(tǒng)計學處理 用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，實驗均重復至少3次，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 RAW264.7細胞24 h形態(tài)學表現（20×）

圖2 MP誘導的RAW264.7細胞24 h形態(tài)學表現（20×）

3 結果

3.1 MP形態(tài) MP生長緩慢，培養(yǎng)10 d后，菌落中心致密隆起，深入瓊脂，周邊較薄，形成“荷包蛋樣”菌落。生化鑒定結果為培養(yǎng)物能發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵尿素和精氨酸，符合MP的特性[5]。

3.2 MP誘導的RAW264.7細胞形態(tài)學表現 鏡下發(fā)現，空白對照組細胞小而圓，視野下輪廓清晰，有光澤，如葡萄串珠狀。細胞在MP刺激后，形狀變大，光澤度減弱，伸出偽足，多為不規(guī)則形態(tài)或梭形。見圖1及圖2。

3.3 祛濕通絡方含藥血清對MP感染的RAW264.7細胞TNF-α表達的影響 結果顯示，模型組、各給藥組與空白對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明在MP的感染下，各組RAW264.7細胞TNF-α的分泌均顯著上升；各給藥組與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表示各給藥組均對TNF-α具有不同程度的下調作用，其中阿奇霉素組對TNF-α的調節(jié)作用最優(yōu)，中藥含藥血清各組呈現出劑量依賴性。見表1。

3.4 祛濕通絡方含藥血清對MP感染RAW264.7細胞IL-6表達的影響 模型組及各給藥組與空白對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明在MP的感染下，各組RAW264.7細胞IL-6的分泌顯著上升；與模型組比較，中藥低劑量組在干預4、8、16、24 h 時無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），表明阿奇霉素組對IL-6的調節(jié)作用最優(yōu)，除中藥低劑量組外，中藥中、高劑量組對IL-6均具有不同程度的下調作用。見表2。

4 討論

MP是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要病原，可引起以間質病變?yōu)橹鞯募毙苑尾垦装Y，同時也是引起全身性病變（如腦炎、心肌炎、肝炎、關節(jié)炎、凝血功能障礙、免疫紊亂等肺外組織或器官病變）的重要致病菌之一。由于其結構缺乏細胞壁，對作用于細胞壁的抗生素藥物（如青霉素與頭孢菌素類）固有耐藥，主要選用大環(huán)內酯類藥物（紅霉素、阿奇霉素等）治療，但近年來發(fā)現耐藥率明顯增加，治療效果欠佳。而且由于抗生素耐藥、過強的免疫炎癥反應等多種原因，少數患者遷延不愈，易發(fā)展成為RMPP。

表1 含藥血清對MP感染RAW264.7細胞的TNF-α表達影響（±s）pg/mL

表1 含藥血清對MP感染RAW264.7細胞的TNF-α表達影響（±s）pg/mL

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 n 4 h 8 h 1 6 h 2 4 h空白對照組 3 8 7.5 6 0± 2.8 0 0 8 8.2 3 5± 2.4 4 8 8 9.8 6 5± 2.5 3 2 8 8.6 3 5±2.3 5 7模型組 3 3 2 6.6 8 2±2 4.4 7 2* 3 0 1.5 4 0±1 1.0 7 8* 2 8 6.3 5 9±1 0.4 0 0* 2 7 5.5 0 5±4.9 5 0*中藥低劑量組 3 2 5 0.3 8 2± 8.5 8 1*# 2 5 0.6 2 0±1 7.1 7 3*# 2 4 6.5 1 6±1 9.3 8 3*# 2 3 2.8 8 2±7.0 2 6*#中藥中劑量組 3 2 2 2.1 5 0±1 5.0 7 6*# 2 3 6.2 2 5± 4.8 3 0*# 2 3 8.5 6 2± 8.1 3 5*# 2 3 1.7 3 8±6.3 0 8*#中藥高劑量組 3 1 7 8.7 7 7± 6.1 1 4*# 1 8 0.9 1 5± 3.0 9 0*# 1 8 3.1 4 9± 6.2 4 9*# 1 7 2.3 5 9±2.9 6 1*#阿奇霉素組 3 1 1 3.5 0 2± 8.4 4 8*# 1 0 4.9 3 5±1 1.9 1 5*# 1 0 4.7 2 3± 3.9 6 8*# 9 9.2 1 4±3.8 2 3*#

表2 各組RAW264.7細胞IL-6表達水平（±s）ng/mL

表2 各組RAW264.7細胞IL-6表達水平（±s）ng/mL

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 n 4 h 8 h 1 6 h 2 4 h空白對照組 3 8.2 2 0±0.3 3 0 7.4 2 8±0.1 0 1 6.7 4 4±0.2 0 4 6.4 7 3±0.5 4 3模型組 3 4 2.8 0 0±0.4 0 8* 4 0.8 1 9±0.3 2 7* 3 8.9 4 0±0.2 0 4* 3 8.6 1 4±0.5 7 4*中藥低劑量組 3 4 0.2 0 8±0.2 8 6* 3 8.3 9 6±0.2 9 8* 3 6.7 5 4±0.2 0 4* 3 6.4 6 5±0.5 7 3*中藥中劑量組 3 3 9.3 3 3±0.3 6 8*# 3 7.7 2 6±0.3 1 9*# 3 6.2 5 5±0.2 0 4*# 3 6.1 7 6±0.4 2 6*#中藥高劑量組 3 3 8.5 8 5±0.3 0 9*# 3 6.2 9 4±0.3 0 0*# 3 4.3 7 4±0.3 7 7*# 3 4.3 7 0±0.6 8 0*#阿奇霉素組 3 3 2.3 2 0±0.3 3 0*# 3 2.7 0 1±1.3 1 5*# 3 0.2 3 5±2.2 0 4*# 3 1.1 7 2±1.2 2 3*#

目前RMPP的治療主要以大環(huán)內酯類抗生素為主，但其用藥時間長，不良反應明顯，且耐藥性日趨嚴重，療效亦有所下降，因此探求有效的中醫(yī)藥制劑已成為廣泛關注的熱點。中醫(yī)學對RMPP的病因認識大致分為內、外因兩個方面，強調其發(fā)病與肺、脾兩臟關系密切。就其內因而言，肺、脾功能失調，是發(fā)病的基礎。究其外因，多責之于外感六淫邪氣及非時之感，寒熱失調，邪犯肺衛(wèi)而發(fā)病。羅磐真認為RMPP是由外邪犯肺，毒蘊化熱，煉液為痰，痰阻氣機，肺氣上逆，則見咳喘氣急；邪正抗爭，相持未減，則高熱不退，強調邪氣外犯是其發(fā)病主因[6]。姚鳳莉根據“濕為陰邪，其性氤氳黏膩”，并結合RMPP纏綿難愈的特點，認為RMPP屬于濕熱證范疇[7]。李新民認為濕邪內生、濕熱互結為重癥MP的病機關鍵，濕熱內蘊，肺氣郁閉，出現熱勢高、稽留難退的臨床特點[8]。李貴尤強調血瘀的重要性，認為肺炎難愈之根本，多由病程日久，氣機被郁而出現血瘀之象，進一步得出痰、瘀、閉、虛為RMPP的發(fā)病機制[9]。治療上馬融提出清熱解毒、活血化瘀、瀉下通腑3大治療大法[10]。姜之炎靈活運用“通補肺絡法”，以益氣健脾、祛瘀消痰為主要治則[11]。李新民采取清上、暢中、滲下三焦同治，清熱、利濕、解毒三法并行[12]。王雪峰重視清肺解毒，配以活血化瘀法，提出應注意中病即止，以防過用苦寒，損脾傷胃[13]。綜上，筆者認為濕熱內蘊是RMPP的病理基礎，MPP患兒的發(fā)熱多表現為弛張熱，午后熱甚，發(fā)熱而不欲飲，面色如常而無紅赤，此為濕遏熱伏，郁蒸于內而致。濕熱內蘊，氣機阻滯，可見脘腹脹悶；濕性纏綿黏滯，則汗出熱不解，口中黏膩，便溏不爽。痰、瘀、閉、虛為其病機關鍵，治療上應清熱祛濕與化痰通絡相結合，則濕熱得解，痰瘀得消，病癥得除。

“祛濕通絡方”是以“甘露消毒丹”為主方，根據張葆青教授多年臨床經驗化裁而成。“甘露消毒丹”為清代葉天士所創(chuàng)，首載于《續(xù)名醫(yī)類案》，后由王孟英收入《溫熱經緯》，善利濕化濁、清熱解毒，主治濕溫初起，邪在氣分，濕熱并重證。“祛濕通絡方”（組成：黃芩、黃連、虎杖、藿香、桃仁、茵陳、蘆根、石菖蒲、甘草）是由“甘露消毒丹”去滑石、川貝母、木通、白豆蔻、薄荷、連翹、射干，加桃仁、虎杖、黃連、蘆根組成。方中茵陳、黃芩、黃連、虎杖并用增強清利濕熱之功，蘆根清熱生津以防熱盛津耗，桃仁、虎杖活血通絡以調暢肺氣。在甘露消毒丹清熱、芳化、利濕的基礎上加上通絡之法，與RMPP的濕-毒-瘀互結的病理機制更加契合。諸藥合用，共奏清熱解毒、化痰祛濕、祛瘀通絡之效。

MP感染的免疫應答包括機體的免疫清除、免疫紊亂、病原體的免疫逃逸，這些免疫機制異常均促進了RMPP的發(fā)生。多項研究表明炎癥細胞因子參與了MP感染的免疫發(fā)病機制[14-15]。RMPP患兒存在高細胞因子血癥，過度產生的細胞因子TNF-α、IL-6等[16]通過與細胞膜上特異性受體結合而發(fā)揮作用，是造成患兒肺部損傷的重要原因。

TNF-α是由激活的單核-巨噬細胞合成和釋放，且具有廣泛生物學活性的炎性介質，其生物學活性作用可根據其濃度高低而有所不同。在正常情況下，機體內TNF-α的濃度較低，有抗腫瘤、抗感染、促進B細胞增殖分化等多種生理功能，可調節(jié)免疫應答，是機體免疫防護的重要介質。當TNF-α濃度過高時，反而會作為重要的炎癥遞質介導炎癥反應的病理生理過程，能增加微血管壁的通透性，并刺激中性粒細胞及內皮細胞表面黏附受體，趨化中性粒細胞等炎癥細胞，啟動炎癥反應，介導感染引起的炎癥損害。MP感染亦可誘發(fā)TNF-α的產生，而增加的TNF-α還可刺激淋巴細胞、單核細胞等產生其他細胞因子參與免疫炎癥反應。研究表明[17]，RMPP患兒血清TNF-α水平明顯高于非RMPP。此外，RMPP患兒TNF-α水平明顯升高[18]，且與病情嚴重程度呈正相關[19]。

IL-6是機體T細胞經過活化后分泌的一種重要免疫調節(jié)因子，也可被TNF-α誘導或多細胞生成。在機體免疫應答初期，作用于血管內皮細胞，可與TNF-α共同參與調節(jié)炎癥反應。IL-6作為一種促炎因子，是細胞因子家族中的核心成員。研究表明[20]，IL-6與過度免疫有關，可作為病情嚴重程度及預后的評估指標。饒鳴皋[21]發(fā)現RMPP患兒的IL-6水平明顯高于普通MPP組，認為RMPP的病情演變極有可能與IL-6有關。史良俊等[22]指出在急性期和恢復期RMPP的IL-6水平均高于普通MPP組，提示RMPP患兒伴有肺組織細胞損傷，且在恢復期仍持續(xù)存在。提示IL-6在RMPP發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，并與病情輕重密切相關，對RMPP的診斷和治療具有重要參考價值。

本研究結果顯示，阿奇霉素、祛濕通絡方均對MP誘導的RAW264.7細胞IL-6、TNF-α高表達具有下調作用，為目前中醫(yī)藥治療MPP提供實驗依據。但MP感染是多細胞因子共同參與的過程，其感染后細胞因子的表達也是一個復雜過程，并且體外細胞上細胞因子的表達與臨床上兒童MPP或RMPP仍有區(qū)別。由于炎癥反應調控機制及中藥成分的復雜性，幾個炎癥反應調控指標的觀察尚不能確定祛濕通絡方的確切作用靶點及作用機制。因此，MP感染后IL-6、TNF-α如何在基因水平上表達以及祛濕通絡方如何在轉錄水平上調節(jié)細胞因子的表達，需要進一步研究。