丹紅注射液通過改善線粒體功能障礙減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷*

陳 燁 ，段真珍 ，楊冬梨 ，李 琳 ，2，3，4，李玉紅 ，2，3，4

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；3.天津市中藥藥理學重點實驗室，天津 301617；4.方劑學教育部重點實驗室，天津 301617）

缺血性心臟病（IHD）嚴重威脅人類健康。雖然發達國家IHD發病率有所降低，但仍占35歲以上人群病死率的1/3[1]。目前臨床采用經皮冠狀動脈介入（PCI）、冠脈搭橋術等治療手段，通過恢復血流供應達到緩解心臟缺血缺氧損傷的目的。然而隨著血流的恢復，心功能障礙和結構損傷有時反而進一步加重，出現心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。MIRI嚴重影響IHD患者預后，因而成為治療IHD的瓶頸之一。線粒體是細胞能量代謝中心，通過呼吸鏈的電子傳遞偶聯磷酸化產生三磷酸腺苷（ATP），以提供細胞生命活動所需能量。研究發現MIRI通過多種途徑介導線粒體通透性轉換孔（mPTP）持續開放，并進一步導致線粒體內膜通透性增加，呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯，從而削弱線粒體能量代謝功能，加速心肌細胞損傷[2]。挽救激酶信號通路磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶（MEK）/細胞外信號調節激酶（ERK）1/2能夠抑制線粒體和心肌細胞損傷，在MIRI中發揮重要作用[3]。

丹紅注射液（DHI）由丹參和紅花組成，臨床上廣泛用于治療心腦血管疾病。丹參酮、丹酚酸、丹參酚酸、紅花黃素為DHI主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等藥理作用。臨床研究表明，DHI能有效減輕心肌梗死引起的心臟損傷[4]。課題組前期研究[5]發現，DHI通過抑制mPTP開放保護缺氧/復氧（H/R）損傷的心肌細胞。王佩等[6]研究發現DHI激活PI3K/Akt信號通路減輕大鼠MIRI。然而DHI對MIRI線粒體氧化磷酸化功能及PI3K/Akt等挽救激酶信號通路調節的線粒體損傷機制尚不明確。因此，本研究擬采用體外H/R損傷的心肌細胞模型，從線粒體能量代謝、PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號通路，研究丹紅注射液對H/R損傷心肌細胞的保護作用，以期為臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 新生1～3 d SD乳鼠，雌雄不分。購于中國醫學科學院放射醫學研究所。

1.2 主要試劑 四甲基噻唑藍（MTT）、PD98059、羅丹明123（Rh123）購于美國Sigma公司，DMEM無糖基礎培養基、DMEM高糖基礎培養基購于美國Gibco公司，RIPA 裂解液、5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液、BCA法蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；β-actin、磷酸化ERK（p-ERK）1/2Thr202/Tyr204、ERK1/2、磷酸化 Akt（p-Akt）Ser473、Akt抗體購于美國 CST 公司；LY294002購于美國Apollo Scientific公司；XF分析培養基、探針水化液、線粒體應激檢測試劑盒購于美國Seahorse Bioscience公司。

2 方法

2.1 原代心肌細胞分離培養與鑒定 出生后1～3 d的乳鼠，75%乙醇浸泡消毒，眼科剪沿左側肋骨快速打開乳鼠胸腔摘取心臟，洗滌后剪碎。加入0.1%Ⅱ型膠原酶和0.06%的胰蛋白酶溶液多次消化。200目篩過濾消化液去除未消化組織塊，離心過濾液，棄上清收集細胞。細胞接種于培養瓶中，二氧化碳（CO2）培養箱差速貼壁1.5 h，收集未貼壁的細胞懸液，重新接種于新的培養瓶中，并于前3 d加用0.1 mmol/L溴脫氧尿苷抑制非心肌細胞的生長。培養2～3 d，待貼壁的心肌細胞連成片狀，觀察細胞形態及搏動情況。

2.2 H/R模型的建立 參照文獻[7]建立細胞糖氧剝奪的H/R模型。缺氧處理開始前，將DMEM高糖培養基換為DMEM無糖培養基，37℃密閉的缺氧小室中缺氧處理9 h。缺氧處理結束后，更換為DMEM高糖培養基，正常CO2培養箱復氧培養2 h。

2.3 實驗分組 實驗分為正常組、損傷組、DHI干預損傷組、DHI和抑制劑干預損傷組、抑制劑干預損傷組。正常組細胞行正常培養，損傷組僅進行H/R損傷處理，DHI干預損傷組細胞缺氧前，用含DHI（10 μL/mL）的DMEM高糖培養基預孵育10 h，且H/R過程中培養液中添加DHI（10 μL/mL）。DHI和抑制劑干預損傷組缺氧前，用含DHI（10 μL/mL）和抑制劑（15 μmol/L 的 LY294002或 20 μmol/L 的PD98059）的DMEM高糖培養基預孵育細胞10 h，H/R過程培養液中均添加上述濃度DHI和抑制劑。抑制劑干預損傷組細胞H/R前，用含抑制劑的DMEM高糖培養基預處理10 h，H/R時培養液中添加抑制劑。

2.4 MTT法檢測細胞存活率 實驗干預結束后，棄孔內液體，每孔加入100 μL DMEM高糖培養基和20 μL 的 MTT（5 g/L）。孵育 4 h 后，吸棄孔內液體，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL/孔，酶標儀讀取570 nm波長下的A值，計算細胞活力。

2.5 線粒體膜電位的測定 細胞經處理后，每孔加入100 μL Rh123工作液，細胞培養箱孵育30 min。熒光酶標儀檢測A值（499 nm/535 nm）。

2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測心肌細胞蛋白表達 實驗干預結束后，提取細胞總蛋白。利用BCA法進行蛋白濃度測定，定量蛋白總量。行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，4℃孵育Akt、p-Akt Ser473、ERK、p-ERK Thr202/Tyr204、β-actin 抗體過夜。TBST洗去一抗，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，化學發光并顯影、定影。

2.7 線粒體呼吸的測定 原代心肌細胞培養2～3 d后，收集細胞并以1×106個/mL接種于XF24細胞培養板中，細胞培養箱孵育5 h后，加入150 μL完全培養基孵育過夜。心肌細胞用含DHI終濃度為1、10 μL/mL的DMEM/F12基礎培基預孵育6 h，直接進行生物能量檢測。H/R處理組缺氧5 h/復氧1 h，并同時給予DHI孵育，再進行線粒體生物能量檢測。通過加入不同的呼吸鏈復合物抑制劑寡霉素（1 μmol/L）、線粒體氧化磷酸化抑制劑（FCCP）（1.5 μmol/L）、抗霉素（1 μmol/L）、魚藤酮（1 μmol/L），檢測基礎耗氧率、最大耗氧率、非線粒體呼吸，并通過計算得出ATP相關的耗氧量、質子漏及儲備能力。

2.8 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 23.0對實驗數據進行統計學分析，實驗結果采用均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 原代心肌細胞的鑒定 倒置顯微鏡觀察，對細胞形態進行鑒定。接種6 h心肌細胞逐漸開始貼壁，呈扁圓形或梭形，無搏動。接種24 h后細胞進一步伸展，出現分叉狀偽足，并開始搏動。培養48 h后，細胞完全貼壁且呈規律性的同步搏動，細胞形態呈梭形、不規則三角形或多邊形，胞漿突起呈偽足狀，且偽足相互連接成片狀生長。見圖1。

圖1 原代培養心肌細胞48 h后生長狀態（200×）

3.2 DHI對H/R損傷后心肌細胞Akt的影響 由圖2可見，與正常組相比，H/R使心肌細胞存活率、Δφm水平顯著下降（P＜0.01）。與損傷組相比，DHI給藥后細胞存活率、Δφm、Akt蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.05或 P＜0.01）。在此基礎上，應用 PI3K 抑制劑LY294002進行干預，與損傷組相比，單獨給予LY294002后，心肌細胞存活率和Δφm沒有顯著改變。與DHI干預損傷組相比，LY294002和DHI共同干預后，DHI對H/R損傷的心肌細胞保護作用被顯著抑制，表現為細胞存活率、Δφm和PI3K下游的Akt蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 DHI對H/R損傷后心肌細胞PI3K/Akt信號通路的影響

3.3 DHI對H/R損傷后心肌細胞ERK1/2的影響 與正常組相比，H/R損傷后心肌細胞存活率顯著降低，DHI可顯著升高心肌細胞存活率，增加心肌細胞內ERK1/2蛋白Thr202/Tyr204位磷酸化水平（P＜0.05或 P＜0.01）。MEK 的抑制劑 PD98059能夠顯著抑制DHI的心肌保護作用，使細胞存活率明顯降低，且抑制DHI對MEK下游ERK1/2的促磷酸化作用，使ERK1/2Thr202/Tyr204的磷酸化水平顯著下降（P＜0.05或 P＜0.01）。見圖 3。

圖3 DHI對H/R損傷后心肌細胞ERK1/2信號通路的影響

3.4 DHI對常氧培養心肌細胞線粒體能量代謝的影響 與正常組相比，DHI預給藥（10 μL/mL）能顯著增加質子漏耗氧率（P＜0.05），但對基礎耗氧率、最大耗氧率、ATP相關耗氧率、非線粒體呼吸耗氧率及儲備能力均無影響。見圖4。

3.5 DHI對H/R損傷的心肌細胞線粒體能量代謝的影響 DHI能夠增加H/R損傷的心肌細胞線粒體基礎耗氧率、最大耗氧率、儲備能力和非線粒體呼吸耗氧率，其中10 μL/mL的DHI干預損傷組更優（P＜0.05或 P＜0.01）。見圖 5。

4 討論

本實驗運用原代培養心肌細胞H/R損傷模型，研究DHI通過激活Akt和ERK1/2，減輕H/R損傷，改善線粒體能量代謝的作用。

圖4 DHI對常氧培養心肌細胞線粒體能量代謝的影響

圖5 DHI對H/R損傷的心肌細胞線粒體能量代謝的影響

再灌注損傷挽救激酶信號通路主要包括PI3K/Akt和MEK/ERK1/2通路。PI3K/Akt通路與細胞生命活動息息相關，參與蛋白質合成、葡萄糖轉運和血管生成等重要生理功能的調控，并介導外界刺激信號誘導細胞生長、增殖、分化、蛋白翻譯、代謝、凋亡等過程[8]。ERK1/2是MAPK家族的成員之一，該家族主要參與細胞增殖分化和生存，該信號級聯在再灌注早期被活化。MEK是ERK1/2的上游激活蛋白。心肌再灌注期RISK途徑中Akt和ERK1/2成為介導心肌保護信號通路的關鍵蛋白，Juhaszova等[9]研究表明，各類不同的心肌保護劑都能激活PI3KAkt和MEK1/2-ERK1/2通路磷酸化，抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），抑制 mPTP 開放，發揮心肌保護作用。實驗通過MTT檢測心肌細胞活力，應用熒光分子探針Rh123檢測心肌細胞Δφm，證明DHI可顯著增加H/R后細胞活力和Δφm，減輕H/R引起的細胞損傷。應用PI3K通路抑制劑LY294002和MEK抑制劑PD98059干預后，抑制了DHI減輕細胞損傷的作用，Western blot蛋白檢測結果也顯示，DHI能增加PI3K和MEK下游的Akt、ERK蛋白磷酸化水平，DHI可能通過激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號通路發揮保護心肌細胞的作用，與文獻研究相吻合[10]。

造成心肌缺血再灌注損傷的主要機制有活性氧的損傷、鈣離子超載、白細胞損傷及高能磷酸化合物生成障礙，線粒體受損及引起的能量代謝障礙在MIRI中扮演著重要角色。線粒體作為細胞呼吸和氧化磷酸化的場所，約80%～90%的ATP是由位于線粒體內膜上的呼吸鏈及ATP合酶加工而成的，心肌缺血缺氧嚴重影響了線粒體呼吸功能[11]，反之線粒體功能障礙，包括能量產生障礙、活性氧的產生、鈣離子超載以及線粒體通路誘導的凋亡等，又進一步加重心肌細胞損傷[12]。線粒體在正常條件下，參與調節細胞的基本生命活動，在應激條件下，介導細胞的分化、凋亡等過程。線粒體的能量代謝狀態是線粒體功能最顯著的表現。質子漏是電子傳遞鏈跨膜泵出的質子通過不涉及ATP合成的途徑而跨膜擴散流回基質的過程，形成了由呼吸鏈驅動的質子泵出和質子回漏的無效循環通路，質子漏在基礎代謝中的作用有：產熱以維持體溫、提高調節代謝的潛能、減少有害自由基的產生和碳流的調節[13]。本研究運用海馬生物能量檢測儀，分別檢測了常氧和H/R狀態下DHI對心肌細胞線粒體呼吸的影響，發現DHI能夠升高常氧培養心肌細胞線粒體質子漏耗氧率，進一步的機制或作用尚需要深入研究。線粒體呼吸儲備能力的大小與細胞應激狀態下自身的調節適應能力相關，細胞儲備能力越大，則其對抗應激狀態、維持細胞正常功能的能力越強[14]。本研究發現，DHI（10 μL/mL）預給藥可通過增加 H/R損傷的心肌細胞基礎耗氧率及最大耗氧率，增加線粒體儲備能力，從而增強心肌細胞抗應激能力，發揮抗H/R損傷的作用。此外，DHI（10 μL/mL）還可增加H/R后心肌細胞的非線粒體呼吸耗氧率。以線粒體的儲備能力增加最為顯著，表明了DHI對H/R條件下心肌細胞能量代謝的改變情況。也可能與DHI抑制了H/R引起的細胞活力降低相關，即增加了細胞活力，降低了細胞凋亡，表現出心肌細胞線粒體基礎耗氧率、最大耗氧率等能量代謝的增強，如果能提取單個細胞或對活細胞進行定量，然后分析其呼吸功能，更能直接體現藥物對線粒體呼吸功能的影響。

此外，線粒體既是ATP的生成中心，為生命活動提供能量，同時也是活性氧產生的主要場所，過多的活性氧對細胞產生損傷，有學者通過研究發現，藥物通過抑制線粒體氧化磷酸化可以保護細胞，人參的有效成分人參皂苷Rb1、Rg1，尤其是人參皂苷Rc能夠抑制大腦皮層和海馬突觸體的線粒體呼吸、氧化磷酸化，改變能量代謝，保護對氧化應激敏感的中樞神經細胞[15]。

綜上所述，DHI能夠激活心肌細胞PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號通路的Akt和ERK1/2，發揮抗H/R損傷的作用，通過改善H/R后線粒體能量代謝狀態，增加心肌細胞儲備能力。DHI對Akt和ERK1/2上游蛋白的調節作用有待進一步研究。