中藥補腎活血湯對2型糖尿病腎病大鼠血清胱抑素C及血、尿β2微球蛋白的機制研究*

熊 丹，胡 維，黃 娟

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病慢性微血管的常見并發癥，也是導致終末期腎病的重要原因，全國慢性腎功能衰竭病因調查結果顯示糖尿病因素居第2位[1]。絕大部分早期腎損害患者無臨床癥狀或缺乏特異性，尿常查和腎功能檢查也多無異常，給早期診治帶來較大困難。近些年有研究表明在DN早期，血清胱抑素c（Cys-c）與血、尿β2微球蛋白（β2-MG）上升更早于血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），可作為早期DN診斷及療效評價的敏感指標[2]。DN屬中醫“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇，以氣陰兩虛為本，瘀血阻絡為標，病位在腎，氣陰兩虛、瘀血阻絡是基本病機。根據DN中醫病機特點和辨證施治思想，本研究建立早期2型DN氣陰兩虛病證結合實驗模型，探討運用中藥補腎活血湯對2型DN大鼠血糖、BUN、Cr、24 h 尿白蛋白（24 h-UAlb）、Cys-c及血、尿β2-MG的影響，分析其可能作用機制，評價補腎活血湯對2型DN的治療作用，詳細報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 本次實驗共收集SPF級Wistar雄性大鼠65只，體質量100～130 g，平均（114.5±10.6）g，均購自湖北省疾病控制中心實驗動物中心。高脂飼料按照基礎飼料87.5%、豬油10%、膽固醇粉2%、膽酸鈉粉0.5%的比例混合配制。

1.2 試劑和儀器 試劑盒：血糖試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BUN、Cr試劑盒購自北京恩濟和生物有限公司；血、尿β2-MG試劑盒購自深圳新產業生物醫學工程股份有限公司；Cys-c試劑盒購自山東博科生物產業有限公司；尿微量白蛋白（umAlb）試劑盒購自山東博科生物產業有限公司。儀器：美國強生公司one Touch Ultrall穩豪血糖儀，美國CD-1600全自動生化分析儀，日本奧林巴斯BX-51顯微鏡和DP70圖像采集系統。

1.3 實驗模型 參考文獻[3]建立2型DN“氣陰兩虛證”大鼠模型。65只大鼠適應性喂養7 d后進行血糖、血壓、血脂、體質量等常規測量，均確保無指標異常大鼠。隨機選取其中15只大鼠作為假手術組，余下50只作為模型制備對象。建立早期氣陰兩虛型2型DN病證結合大鼠模型，具體方法：1）單腎切除：除假手術組外，大鼠常規1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉消毒后，行背部切口1.5 cm，剝離腎臟脂肪、腎上腺，左腎門血管結扎，切除左腎后縫合切口，術后常規處理。假手術組切口后僅行暴露左腎、縫合切口處理。2）高脂飼料：除假手術組外，單腎切除術后7 d給予高脂飼料正常喂養，假手術組給予基礎飼料喂養，持續2周。3）鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射：除假手術組外，均給予STZ 30 mg/kg腹腔注射，假手術組注射等劑量0.1 mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。72 h后行口服葡萄糖耐量（OGTT）實驗，血糖儀檢測空腹血糖（FBG）≥5.6 mmol/L或負荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L表示模型初步建立。4）行為干預：除假手術組外，采用饑飽失常、勞逸無度、驚嚇刺激等途徑干預，假手術組繼續常規飼養。

1.4 模型分組及處理 參考文獻[4]進行行為干預，除假手術組外，采用隨機數字表法將余下50只模型制備大鼠分為模型組（15只）、補腎活血組（20只）、貝那普利組（15只）。其中補腎活血組給予中藥補腎活血方10 g/（kg·d）灌胃，補腎活血湯由黃芪、太子參、生地、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、五味子、赤芍、三七等中藥組成，用“水煮醇提法”制備成浸膏，用生理鹽水稀釋成含生藥2.5 g/mL的溶液。貝那普利組采用貝那普利（諾華制藥）10 mg/（kg·d）灌胃處理，用生理鹽水稀釋成2 mg/mL的溶液。假手術組、模型組兩組給予飲用純凈水灌胃處理，灌胃純凈水體積同補腎活血組、貝那普利組灌胃藥液體積，4組均于連續灌胃處理20周。若研究中途有大鼠死亡則予以剔除。

1.5 標本采集及檢測方法 均于實驗結束前1周采用金屬代謝籠收集24 h尿標本，記錄尿量后取10 mL尿標本。OGTT實驗結束后禁食12 h，以戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈取血，分離血清，以備檢測。血糖[FBG、餐后2 h血糖（PBG）]測定用葡萄糖氧化酶法，超氧化物歧化酶（SOD）用黃嘌呤氧化酶法，丙二醛（MDA）用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，BUN用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法，Cr用酶聯免疫吸附法，umAlb用免疫透射比濁法，血、尿β2-MG用化學發光法，Cys-c用免疫比濁法，所有指標均嚴格按試劑盒說明書進行檢測。剝離摘取大鼠右側腎臟，冰生理鹽水清洗后吸干表面水分，10%福爾馬林固定72 h，制備4 μm石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理特征。

1.6 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件分析處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗模型大鼠基本情況 假手術組：大鼠體態正常，進食、飲水、排泄、運動、睡眠等均正常，無死亡；模型組：大鼠體態衰弱，毛發稀少枯黃，四肢纖瘦乏力，少動嗜睡，排泄習慣及排泄物形態異常，死亡2只；補腎活血組：大鼠體態稍次于假手術組，明顯優于模型組，大鼠進食、飲水、睡眠習慣、排泄等基本正常，毛發略有干枯，顏色略微暗淡，運動量稍有減少，死亡1只；貝那普利組大鼠體態次于假手術組、補腎活血組，優于模型組，大鼠進食、飲水、運動量有一定減少，排尿次數增多，毛發干枯稀少，毛發枯黃，四肢纖瘦乏力，死亡2只。

2.2 不同分組大鼠FBG、PBG指標比較 與假手術組比較，模型組、補腎活血組、貝那普利組血FBG、PBG均顯著偏高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血組血FBG、PBG明顯偏低，差異有統計學意義（P＜0.01），貝那普利組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.3 不同分組血清和腎皮質SOD、MDA比較 與假手術組比較，模型組、補腎活血組、貝那普利組血清和腎皮質MDA均升高，SOD下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血組、貝那普利組血清和腎皮質MDA更低，SOD更高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與貝那普利組比較，補腎活血組血清和腎皮質SOD、MDA也明顯更優，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表1 各組大鼠FBG、PBG檢測結果比較（±s）mmol/L

表1 各組大鼠FBG、PBG檢測結果比較（±s）mmol/L

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 n F B G P B G假手術組 1 5 4.1 3±0.4 0 5.3 6±0.6 4模型組 1 3 8.5 0±1.1 8* 1 4.0 5±2.7 1*補腎活血組 1 9 7.2 3±0.8 6*# 1 0.6 6±1.8 9*#貝那普利組 1 3 8.0 5±0.9 7* 1 2.7 3±2.1 5*

表2 不同分組大鼠血清和腎皮質MDA、SOD比較（±s）

表2 不同分組大鼠血清和腎皮質MDA、SOD比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與貝那普利組比較，△P＜0.05。

S O D（U/m L）假手術組 1 5 2.9 1±0.4 2 2 8 4.6 2±2 2.7 4 1.3 1±0.0 5 1 0 2.6 5±2 4.8 0模型組 1 3 5.0 2±0.4 6* 1 8 5.9 4±2 4.3 6* 2.5 0±0.5 4* 7 2.6 9±1 2.5 7*補腎活血組 1 9 4.1 0±0.5 1*#△ 2 4 7.5 0±2 9.7 0*#△ 2.0 1±0.3 5*#△ 9 4.0 9±1 5.3 1*#△貝那普利組 1 3 4.3 5±0.6 7*#2 1 8.3 8±1 8.9 5*#2.1 5±0.4 1*# 8 5.1 3±1 4.5 0*#組別 n血清 腎皮質M D A（n m o l/m L）S O D（U/m L）M D A（n m o l/m L）

2.4 不同分組大鼠腎功能 BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG指標比較 與假手術組相較，模型組、補腎活血組、貝那普利組BUN、Cr均升高，但無統計學差異（P＞0.05），模型組、補腎活血組、貝那普利組24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG均偏高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血組、貝那普利組 24 h-UAlb、Cys-c、血尿 β2-MG均降低（P＜0.05）；模型組與貝那普利組比較，24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 各組大鼠腎組織病理特征 假手術組大鼠光鏡下可見清晰腎小管、小管間質區結構，腎小管上皮細胞大小及排列正常，基底膜完整。模型組可見局部腎小管間質纖維化，并伴有明顯炎性細胞浸潤和腎小球系膜細胞增生，腎小管上皮細胞可見脫落和顆粒變性等。補腎活血組可見腎小管、小管間質區結構等基本正常，伴有部分腎小球系膜細胞輕度增生和少量腎小管上皮細胞顆粒變性。貝那普利組可見局部腎小管間質輕度纖維化和炎性細胞浸潤，伴有腎小管水腫、細胞顆粒變性和腎小球萎縮等。各組大鼠腎組織病理特征病變程度由正常至嚴重依次為假手術組、補腎活血組、貝那普利組、模型組。

3 討論

DN的發病機制目前尚不明確，早期進行有效診治可延緩病情的進展。血清Cys-c是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，主要由機體所有有核細胞產生。循環中的Cys-c可經腎小球自由濾過，在近端腎小管上皮細胞被完全分解，腎臟是唯一清除Cys-c的器官，因此，血清Cys-c是一種反映腎小球濾過率變化的理想同源性標志物[5]。研究表明血清Cys-c與腎小球濾過率呈良好的線性關系，且早于、優于Cr，檢測血清Cys-c可明確DN的進展情況[6]。β2-MG由淋巴細胞等合成并分泌到血液及體液中，血液中的β2-MG可以從腎小球自由濾過，99.9%在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細胞中被分解[7-8]。當腎小球濾過功能下降時，血β2-MG開始升高，因而能夠及時反映腎小球濾過功能的損傷[7]；當腎小管功能發生異常時，重吸收功能下降，尿β2-MG含量升高[9]，因而尿β2-MG是診斷腎小管功能損傷，尤其是近曲小管功能損傷的敏感性指標。李波等[10]的臨床試驗結果顯示血清Cys-c、β2-MG比Cr、BUN能更敏感、更準確地反映腎小球濾過率，對早期診斷腎功能損害具有重要臨床價值。

DN屬中醫“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇，以氣陰兩虛為本，瘀血阻絡為標，病位在腎。患者消渴日久，化燥傷陰耗氣，終致氣陰兩虛；氣虛則氣血津液運行不暢，瘀血、痰濁阻絡。根據DN氣陰兩虛、瘀血阻絡的基本病機，本研究采用中藥補腎活血湯辨證治療，配方由黃芪、太子參、生地、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、三七、五味子等配伍而成，方中黃芪、太子參、山藥健脾益氣，使氣行血行。黃芪味甘性溫，可溫補肺、脾、腎，疏利三焦，利水消腫[11]。生地清熱涼血，養陰生津。山茱萸補益肝腎，收斂固澀。現代藥理學證實生地、山茱萸治療DN具有協同增益作用，可有效抑制DN患者糖基化產物產生，抑制細胞外基質（ECM）增生和轉化生長因子（TGF）-β表達，改善或延緩DN腎小球硬化[12]。茯苓健脾滲濕、利水消腫。牡丹皮清熱涼血，活血化瘀。三七止血散瘀，補虛消腫。五味子益氣生津，補腎寧心。諸藥配伍共奏滋補脾腎、活血通絡和益氣養陰之功效。

表 3 各組大鼠 BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血 β2-MG、尿 β2-MG 檢測結果比較（±s）

表 3 各組大鼠 BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血 β2-MG、尿 β2-MG 檢測結果比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別n B U N（m m o l/L）C r（m m o l/L）假手術組 1 5 5.2 4±0.5 9 3 9.0 6±6.1 5模型組 1 3 5.7 5±0.9 4 4 4.5 3±6.8 4補腎活血組 1 9 5.2 3±0.6 1 4 1.6 7±5.7 6貝那普利組 1 3 5.5 7±0.7 4 4 2.8 1±5.9 7 2 4 h-U A l b（μ g/2 4 h）1 6 8.4 1±2 9.3 7 1 4 2 8.5 4±3 2 7.6 3*8 9 6.4 0±2 4 1.4 8*#9 1 7.2 9±2 7 5.9 1*#C y s-c（m g/m L）0.0 7 8±0.0 1 7 0.1 5 7±0.0 2 8*0.1 2 2±0.0 2 3*#0.1 2 4±0.0 1 7*#血 β 2-M G（n m o l/m L）0.0 3 4±0.0 1 2 0.1 2 5±0.0 3 7*0.0 9 4±0.0 1 1*#0.0 9 7±0.0 1 6*#尿 β 2-M G（m m o l/m L）0.0 0 9 1±0.0 0 1 7 0.0 1 4 3±0.0 0 3 1*0.0 1 0 7±0.0 0 2 8*#0.0 1 2 9±0.0 0 2 7*#

本研究顯示模型組大鼠的血糖、血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均明顯升高，但腎功能尚正常，血清BUN、Cr升高并不顯著，符合早期氣陰兩虛型2型DN特點。補血活血組和貝那普利組用藥治療20周后，大鼠血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均較模型組降低（P＜0.05），且兩組療效相近，與胡愛民等[13]報道結論相吻合，證實了補腎活血方能改善2型DN的腎功能，對腎臟具有保護作用。

本研究還對補腎活血湯保護腎臟功能的作用機制進行探究，結果顯示模型組、補腎活血組和貝那普利組大鼠血清和腎皮質MDA均明顯高于假手術組，SOD水平顯著下降，提示DN大鼠存在氧化應激損傷，與DN的發生及進展可能存在緊密關聯。DN大鼠高糖誘導線粒體呼吸鏈產生的活性氧（ROS）超過抗氧化物質的清除能力，會誘導氧化應激發生。其參與DN的發生、進展機制可能是：ROS損傷足細胞、內皮細胞等破壞腎小球濾過屏障；ROS上調系膜細胞內纖溶酶-1（PAI-1）表達和下調纖溶酶原激活劑（PA）表達，抑制腎小球系膜細胞降解ECM的能力，引起ECM沉積和腎內機制重構、腎小管間質纖維化等；ROS參與腎小球內高壓的形成等。此外有報道指出補腎活血中藥方可能通過降低TGF-β1、miR-192等表達，提高Smad相互作用蛋白1（SIP1）表達等途徑保護DN大鼠腎臟功能[14]，在后續研究有待深入完善。