蛇床子素/殼聚糖衍生物膠束對去卵巢骨質疏松大鼠骨微結構和骨吸收的影響

郭楊 王禮寧 馬勇* 鄭蘇陽 潘婭嵐 孫杰 司譽豪 涂鵬程 徐桂華

1.南京中醫藥大學骨傷修復與重建新技術實驗室，江蘇 南京 210023 2.南京中醫藥大學附屬醫院骨傷科，江蘇 南京 210029 3.南京中醫藥大學慢性病中醫護理干預實驗室，江蘇 南京 210029

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)就是由于骨形成和骨吸收失衡所造成的一種以骨密度降低、骨脆性增加為特征的全身性骨骼疾病[1]。其導致的脆性骨折等并發癥將嚴重影響中老年人的生活質量，已成為全球性的健康問題。目前，市面上常見的抗骨質疏松藥物如雙膦酸類、雌激素受體類藥均有吸收性差、不良反應較多的缺陷。因此，往往無法取得令人滿意的療效。

中醫藥已被證明具有抗骨質疏松潛能的天然產物備受人們的關注。蛇床子素(Osthole，OST)，作為中藥蛇床子中一種主要的活性成分?，F代藥理學研究已發現其具有抗炎、護肝、抗腫瘤、延緩老年癡呆等藥理作用[2-4]。本課題組前期體外研究發現：一方面，OST可以通過激活Wnt/β-Catenin信號通路和內質網應激從而刺激成骨細胞的增殖、分化，并最終促進新骨形成[5]；另一方面，OST也可以通過抑制NF-κB信號通路的表達而引起NFATc1等相關轉錄因子的下調來抑制破骨細胞的分化成熟[6]。然而，由于OST難溶于水且吸收性差，常造成藥物生物利用度下降，為克服這些問題，課題組借助中醫學“相須”理論和“藥食同源”理念，合成了未見文獻報道的新型蛇床子素/殼聚糖衍生物膠束(Osthole-loaded N-octyl-O-sulfonyl chitosan micelles, NSC-OST)，并初步在體外觀察了其藥效[7-8]，但其在體內藥理作用的發揮尚需要進一步研究。因此，本文計劃通過建立去卵巢骨質疏松大鼠模型，初步觀察其對大鼠骨微結構與骨吸收現象的影響。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級未經產的3月齡雌性SD大鼠共40只，體重為(200±15)g，由南京市江寧區青龍山實驗動物養殖場提供，實驗動物合格證書：SCXK(蘇)2012-0008。本研究項目的所有開展過程已得到南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準(項目編號：ACU170804)。

1.2 試劑與儀器

試劑：蛇床子素標準品(中國食品藥品檢定研究院，HPLC>99.8%)；蛇床子素/殼聚糖衍生物膠束(NSC-OST)由中國藥科大學合成并提供；尼爾雌醇(中國食品藥品檢定研究院)；抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(美國 SIGMA公司)；鼠抗大鼠NFATc1單克隆抗體(貨號：sc-7294)、鼠抗大鼠CTSK單克隆抗體(貨號：sc-48353)、鼠抗大鼠c-Fos單克隆抗體(貨號：sc-166940)，購自美國SANTA CRUZ公司；二甲苯、HE染液、切片石蠟、脫鈣液、多聚甲醛(南昌雨露病理生化試劑公司)；注射用青霉素鈉(四川制藥有限公司)、羧甲基纖維素鈉(國藥)。

儀器：倒置相差顯微鏡CKX31型(日本 Olympus光學儀器株式會社)；小動物Micro CT測試儀1176型(比利時 Skyscan公司)；全自動硬組織切片機RM2265型(德國 徠卡公司)；生物組織冷凍臺YD-6 L型、生物組織包埋機YD-6 L型、生物組織烤片機YD-B型、組織染色機YD-700型，購自中國金華益迪公司。

1.3 動物造模與分組給藥

造模方法：術前10 h禁食，手術當天用2.5%的戊巴比妥鈉按照30 mg/kg的劑量進行腹腔麻醉，于肋下2 cm進行常規消毒，于脊柱兩側旁開約1.5 ～2 cm處行2 cm左右的切口，逐層剝離，找到桑葚樣的卵巢后進行結扎并切除，術后3 d肌注青霉素預防傷口感染。

分組方法：分組及各組給藥劑量具體如下：①假手術組給予等體積生理鹽水(0.5%羧甲基纖維素鈉)；②模型組給予等體積生理鹽水(0.5%羧甲基纖維素鈉)；③尼爾雌醇組按照1 mg/(kg.week)給藥一次，每次給藥3 mL，其余時間給予上述同體積溶劑灌胃；④蛇床子素組按照10 mg/(kg.d)給藥，每天給藥3 mL；⑤蛇床子素/殼聚糖衍生物膠束組按照100 mg/(kg.d)(OST的載藥量為10%，OST實際含量保持一致)，每天給藥3 mL；上述組別均連續灌胃12周后，麻醉后雙側脛骨和股骨-80 ℃保存備用。

1.4 Micro-CT

根據之前文獻報道的協議[9]，設定CT掃描參數為分辨率9 μm、電壓65 kV、電流384 mA和1 mm濾鏡。掃描結束后，使用系統內置的軟件Nrecon 1.6和CTAn 1.14對每一個標本選取統一的感興趣區域(regions of interest, ROI)：距髁間窩生長板0.5 mm，長3 mm的一段松質骨進行重構，使用建模軟件CTan分析構建二維與三維圖像，采用上述軟件進一步分析骨松質形態計量學參數，包括骨體積分數(BV/TV)、三維骨密度(3D BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.5 HE染色

將左側股骨置于4%多聚甲醛中固定24 h后，用10% EDTA溶液脫鈣4～6周，脫鈣完成以針刺無阻力感為標準；截取1.5 cm左右股骨遠端部分，并進行乙醇梯度脫水；二甲苯溶液透明；常規石蠟包埋；切取石蠟切片厚度為5 μm，常規行HE染色，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下觀察骨組織的微形態結構。

1.6 TRAP染色

按照試劑盒說明配置新鮮的TRAP染液，將空白的石蠟切片放入預熱37 ℃的染液中避光浸染1 h，然后用蘇木精染液復染細胞核，蒸餾水漂洗、中性樹脂封片后，顯微鏡下觀察并采集圖像后用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0分析單位骨小梁面積破骨細胞數(number of osteoclasts per bone surface, N. Oc/BS)和單位骨小梁破骨細胞面積比(osteoclast surface per bone surface, Oc. S/BS)。

1.7 免疫組化

將石蠟切片置于二甲苯溶液中脫蠟10 min，乙醇梯度(高至低：100%、95%、80%、70%)各2 min水化，先后用蒸餾水、PBS溶液漂洗3 min；室溫下用預熱的封閉通透液避光浸潤切片30 min，PBS溶液漂洗兩次，3 min/次；檸檬酸鈉溶液抗原修復，微波爐里高火4 min至沸騰，然后自然冷卻至室溫，PBS溶液洗3次，3 min/次；血清封閉37 ℃溫箱中30 min；一抗孵育4 ℃過夜，PBS漂洗3次，3 min/次；二抗孵育37 ℃ 1～2 h，PBS洗3次，3 min/次；DAB顯色，顯色后終止反應，蘇木精復染30 s，水漂洗 15 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；置于顯微鏡下觀察。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 NSC-OST對股骨三維形態計量學參數的影響

Micro-CT掃描和三維重建是用來評估大鼠模型中的骨微觀結構變化的有效手段。其中模型組對比假手術組表現出明顯的骨小梁流失。然而，對比模型組，口服NSC-OST可明顯提高大鼠的BMD和BV/TV(P<0.05)，并明顯改善Tb.N、Tb.Sp、Tb.Th三項指標(P<0.05)(圖1-A、1-B)，總體效果要優于OST組，但略遜于Nil組。表1。

2.2 NSC-OST對股骨組織病理學形態的影響

根據圖2結果顯示，Sham組大鼠骨小梁結構均勻分布，排列整齊并互相連接呈網狀，形態較為完整；Ovx組骨小梁結構明顯變細，骨皮質變薄，形態結構性差，有扭曲和斷裂的現象，骨質疏松樣改變典型。Nil、 OST組和NSC-OST組經過治療后，骨組織形態結構改善明顯，其中Nil組骨微結構的改善效果最明顯，NSC-OST組次之，最后是OST組。具體表現為骨小梁稍細，排列尚整齊，排列部分呈網狀，間隙略大，形態結構基本完整。

2.3 NSC-OST對股骨組織中破骨細胞數量的影響

染色結果顯示，OVX組的破骨細胞較假手術組明顯增多，OST和NSC-OST能明顯抑制破骨細胞的生成，NSC-OST的抑制效果更明顯(圖3)。采用Image-J進行圖像分析顯示，模型組N. Oc/BS和Oc. S/BS較假手術組受到明顯抑制(P<0.05)，藥物組均能一定程度的改善這兩項參數(P<0.05)，其中Nil組改善效果最明顯，NSC-OST組次之，然后則是OST組(表2)。以上結果提示NSC-OST能在體內外均顯著的抑制破骨細胞的生成和活性。

圖1 NSC-OST對大鼠三維股骨微結構的影響注：A 股骨矢狀面骨結構的二維掃描圖； B 股骨骨微結構的三維建模圖。Fig.1 Effect of NSC-OST on 3D femoral microstructure in rats

表1 NSC-OST對股骨三維形態計量學參數的影響Table 1 Effect of NSC-OST on 3D bone morphometrics

圖2 各組股骨組織的HE染色結果(100×)Fig.2 HE staining results of femoral tissues in each group(100×)

2.4 NSC-OST對股骨組織中破骨細胞特異性分子的影響

股骨遠端的免疫組化結果顯示，OVX組中的NFATc1、c-fos、CTSK的表達較假手術組均顯著增強，但Nil、OST、NSC-OST組干預后均能發揮不同程度地抑制作用。其中，Nil組和NSC-OST組在抑制NFATc1、c-fos方面效果較好，二者作用相當；Nil組抑制CTSK的作用最強，而OST組和NSC-OST組在該指標上作用相似，見圖4。

圖3 各組股骨組織的TRAP染色結果(200×)Fig.3 TRAP staining results of femoral tissues in each group(200×)

表2 NSC-OST對股骨破骨細胞數量參數的影響

圖4 NSC-OST對破骨特異性標志分子NFATc1、c-Fos、CTSK的作用(n=3，200×)Fig.4 Effects of NSC-OST on osteoclast-specific molecules NFATc1, c-Fos, and CTSK in rat femurs (n=3, 200×)

3 討論

配伍是中藥處方的靈魂，而“相須”配伍作為復方中最常見的一種配伍方式，指的是性能功效相類似的兩種藥物配伍使用后可以增強某種或幾種組成的治療效應，本文中NSC-OST的合成制備思路正是來源于中醫“相須”配伍的理論。另外，骨質疏松癥的中醫藥防治講究“藥食同源”，常以動物的殼或骨用作藥膳食材，而殼聚糖則正是來源于魚蝦蟹殼的主要成分——甲殼素，其來源廣泛，并可通過結構修飾形成兩親性聚合物膠束，產生一定的親骨性，再通過物理包埋藥物，增溶難溶性藥物，提高生物利用度[10]。同時，殼聚糖也具有促進骨形成效應的生物學作用，且已在骨組織工程中得到了一定范圍的應用[11]。因此，基于OST在抗骨質疏松上表現出的良好前景，課題組前期成功制備了具有良好親水性的NSC-OST，并在本文中進一步觀察其對去卵巢骨質疏松大鼠模型的藥理學效應。

Micro-CT掃描可以得到松質骨和皮質骨的骨三維圖像，具有相當高的分辨率，通過軟件分析可以較精確地測得骨量及相關骨微結構參數，是目前檢測骨質疏松嚴重程度的最佳技術手段之一。造模后3D BMD、BV/TV的降低表示了骨量的下降，OST可以一定程度提高模型組的3D BMD、BV/TV值，而NSC-OST則強化了這一作用。Micro-CT還可直接分析獲取骨小梁的參數，包括：Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp等，這些數據均提示了卵巢切除術可導致骨小梁數量減少，骨質進一步流失。而OST可一定程度上拮抗失去卵巢所引起的骨質疏松，但效果仍不如Nil。NSC-OST則進一步強化了OST的效果，可更有效地逆轉骨小梁的減少，減緩骨質疏松的疾病進程。

而HE染色也驗證了以上實驗結果，提示NSC-OST可以顯著改善大鼠股骨的骨微結構；同時綜合大鼠股骨的TRAP染色結果發現：NSC-OST可以明顯抑制N. Oc/BS和Oc. S/BS，抑制破骨細胞的生成，提示NSC-OST的抗骨質疏松效應可能和抑制破骨細胞分化的能力有關。

NFATc1是破骨細胞形成和分化過程中不可或缺的轉錄因子之一[12-14]。此外，NFATc1在破骨細胞的骨吸收功能的激活中也發揮了重要的作用[15]。NFATc1敲除的胚胎干細胞將無法成功分化為破骨細胞，然而破骨前體中NFATc1的異位表達又能使其在RANKL缺失的條件下成功分化，靶向破壞小鼠造血細胞中的NFATc1能使破骨細胞數量明顯減少，骨量顯著增加[16]。c-Fos作為NFATc1上游的重要調控分子，同時也是一種必不可少的RANK/RANKL通路下游轉錄因子[17]，c-Fos純合子小鼠可表現為由于破骨細胞缺失而引起一系列骨硬化等功能障礙[18]。CTSK作為破骨細胞分泌的一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，骨骼中的膠原蛋白等其他基質可在骨吸收的過程中被其溶解。相關基因測序發現，CTSK突變的情況存在于常染色體隱形骨壞死患者(骨硬化癥)，這一現象也符合高密度情況下的分子診斷結果[19]。本研究結果表明：造模后的大鼠股骨骨中破骨特異蛋白NFATc1、c-Fos和CTSK表達量明顯上調，而NSC-OST可抑制上述蛋白的表達上調，NFATc1、c-Fos蛋白表達的抑制作用NSC-OST組與Nil組相當，而NSC-OST抑制CTSK與的作用則不如Nil組，與OST組相似。

綜上，NSC-OST在體內良好藥效的發揮，也進一步揭示了其作為一種安全有效的抗骨質疏松藥物的潛能。本研究證明了在中醫經典理論指導下合成的NSC-OST，其顯著的抗骨質疏松的效應發揮與其對破骨細胞及其骨吸收的抑制作用有關，但其具體分子機制仍待進一步探究。