基于DNA量子點復(fù)合熒光探針的沙門氏菌定量檢測

王旗 程小翠 夏娟

摘 要：鼠傷寒沙門氏菌是我國最常被報道的食源性致病菌之一，已對食品安全和公眾健康造成了嚴重的威脅。本研究將金納米粒子和DNA量子點構(gòu)建了一種新型的自組裝核-殼結(jié)構(gòu)熒光探針，并結(jié)合磁分離技術(shù)用于定量的檢測鼠傷寒沙門氏菌DNA。聚乙烯亞胺包覆的金納米粒子能夠通過靜電吸附作用結(jié)合大量的DNA量子點來放大熒光信號，并可以簡化核酸適配體修飾探針的繁瑣過程。復(fù)合熒光探針在5fmol L-1到5.0×103fmol L-1的范圍內(nèi)可以成功檢測到傷寒沙門氏菌DNA，檢測限為7.5fmol L-1。此外，由于金納米粒子和DNA量子點的合成方法簡單，本研究設(shè)計合成的復(fù)合探針將適用于該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員。因此，這種新型探針可以方便、有效地檢測沙門氏菌。

關(guān)鍵詞：DNA量子點;金納米粒子;羧基化磁珠;適配體;沙門氏菌

中圖分類號：TN791? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）09-0076-06

近些年，伴隨著層出不窮的食品安全問題，保障食品安全是當前社會共同關(guān)注的重大問題[1]。食品在加工、貯運時，極有可能會受到很多種食源性致病細菌的污染，食源性致病菌是常見的致病微生物，是指源于食品并且在人類被感染后會導(dǎo)致發(fā)生疾病的細菌，其種類主要包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等[2]。其中，沙門氏菌主要寄生在人和動物的腸道內(nèi)，是一種可以使人畜共患病的病原微生物，它能夠引起人類發(fā)生急性腸胃炎、傷寒、副傷寒、敗血癥等疾病。沙門氏菌是最常見的食源性致病菌之一，食物如果被沙門氏菌感染，造成的疾病常是大面積的爆發(fā)，致病速度十分快，對食品安全和公眾健康構(gòu)成嚴重的威脅[3]。據(jù)統(tǒng)計，我國每年由食源性致病菌引起的疾病而造成健康和財產(chǎn)損失的報告數(shù)量十分巨大，因此加強對食品中食源性致病菌的檢測就顯得至關(guān)重要[4]。

傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測方法主要包括平板分離法、化學分析法、分子生物法和免疫學檢測法，如我國國標（GB47989.4-2016）規(guī)定沙門氏菌檢測方法為平板分離法[5]，主要為增菌、分離、生化試驗和血清學鑒定等幾個步驟。國標法雖然檢測結(jié)果穩(wěn)定性好，但該種方法十分耗時，并且檢測從不同樣品部位分離得到的沙門氏菌，檢測的結(jié)果也不是完全一致的[6]。因此，需要開發(fā)出更加簡便易操作的、穩(wěn)定快速的方法來替代這些傳統(tǒng)技術(shù)。隨著科學技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，目前有著許多新型現(xiàn)代的檢測方案可以用于完成鼠傷寒沙門氏菌的檢測，例如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）和表面增強拉曼散射（SERS）等[7]。然而，由于操作流程復(fù)雜、技術(shù)要求高、儀器昂貴等因素，以上這些各具優(yōu)勢的檢測方案在普通檢測機構(gòu)或?qū)嶒炂脚_難以被檢測人員所采用[8]。所以，設(shè)計開發(fā)出一種易于操作的細菌測試方案在實際檢測工作中是迫切需要的。

據(jù)目前已有的報道稱，免疫磁分離技術(shù)（IMS）與熒光分析技術(shù)結(jié)合的檢測方法因其操作簡單和性能穩(wěn)定，被廣泛應(yīng)用于各種檢測行業(yè)當中[9]。一方面，基于IMS技術(shù)可以利用包覆了細菌抗體的磁珠（MBs）從食品樣品中有效的分離待檢測目標菌[10];另一方面，由量子點構(gòu)建的熒光探針在熒光分析中發(fā)揮著非常重要的作用，但在大多數(shù)的方法中都將其設(shè)計為抗體或適配體與量子點一對一的結(jié)合模式，大大降低了檢測的靈敏度[11]。為了克服上述困難，本研究設(shè)計并構(gòu)建了一種新型的自組裝核-殼結(jié)構(gòu)熒光量子點探針，該熒光探針由DNA量子點（DNA-QDs）和金納米粒子（AuNPs）組成。金納米粒子可以吸附結(jié)合大量的DNA量子點，在充分利用細菌上有限特異性結(jié)合位點的同時，極大地增強了單個細菌的熒光強度。另外，此新型熒光探針的整個制備過程可以由一般技術(shù)人員在很短的時間內(nèi)通過簡單的操作完成，且兼?zhèn)涑杀镜秃铜h(huán)境友好的特性。

目前，量子點熒光探針已被廣泛應(yīng)用于多種行業(yè)的檢測當中[12]。例如，在食源性致病細菌的檢測中，熒光量子點與磁分離技術(shù)相結(jié)合，可以有效地對特定致病菌進行熒光檢測和熒光分析。但不幸的是，大多數(shù)的熒光量子點（QDs）是在比較苛刻的條件下合成的，包括使用重金屬、添加有毒試劑和配體、原材料昂貴、制備過程復(fù)雜等[13]。例如，膠體半導(dǎo)體量子點具有較長的熒光壽命，但其本身或其使用的溶劑（或配體）有毒，還需要使用重金屬[14]。碳質(zhì)量子點原材料廉價且無毒，但熒光壽命短，合成后還需要進一步純化。另外，不同的量子點在應(yīng)用于各種檢測之前，還需要進行繁瑣和復(fù)雜的表面修飾，對技術(shù)人員的要求較高，很難被一般的檢測機構(gòu)所掌握運用。與傳統(tǒng)的QDs相比，DNA-QDs以廉價易得的單鏈DNA（ssDNA）為原料，在溫和的水熱條件下，通過DNA堿基間的相互作用，即能合成尺寸在1.6nm左右的生物量子點。此外，在DNA-QDs的合成過程中，DNA的堿基結(jié)構(gòu)、主鏈上的PO4-1以及生物相容性都能被很好地保留下來[15]。因此，來源于DNA的量子點除了具有獨特的熒光性質(zhì)外，還具有生產(chǎn)工藝簡單、熒光穩(wěn)定、熒光壽命長、環(huán)保無污染、生物相容性好等優(yōu)點[16]。

金納米粒子因其獨特的性質(zhì)，如易于制備、生物相容性好和基本無毒性等而被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域[17]。在本研究中，AuNPs的制備僅需要添加聚乙烯亞胺（PEI）并進行攪拌。在室溫條件下，快速攪拌PEI和HAuCl4，PEI分子鏈上的叔胺可以作為還原劑和穩(wěn)定劑[18]，制備出的AuNPs-PEI尺寸在9nm左右。AuNPs-PEI的表面因PEI的包覆而富含大量的氨基，與帶有PO4-1的DNA-QDs可以通過靜電吸附作用即可自組裝合成復(fù)合熒光探針，無須額外進行表面修飾，節(jié)省時間的同時也降低了技術(shù)難度。另外，金（Au）對巰基（SH基）具有很強的親和性，修飾了SH基的適配體可以與納米金粒子直接形成Au-S的配位共價鍵[19]，避免了繁瑣的表面修飾。

本研究中設(shè)計以DNA量子點與金納米粒子復(fù)合制備熒光探針，工藝簡單、綠色環(huán)保、生產(chǎn)成本較低，由一個普通的技術(shù)人員通過簡單的操作，在很短的時間內(nèi)即可完成。此外，每個金納米粒子作為載體可以吸附并結(jié)合大量的DNA-QDs后再連接到檢測目標上，極大程度地增加了單位熒光強度，進而提高了檢測靈敏度。在最佳的實驗條件下，復(fù)合熒光探針在5fmol L-1到5.0×103fmol L-1的范圍內(nèi)可以成功檢測到傷寒沙門氏菌DNA，檢測限為7.5fmol L-1。因此，本研究設(shè)計的檢測方案具有適用于普通技術(shù)人員應(yīng)用于其他種類檢測的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基化磁珠（COOH-MBs，200-300nm）、三水氯金酸（HAuCl4·3H2O）、聚乙烯亞胺（PEI），以上試劑購自Sigma Aladdin公司;NHS、EDC、MES購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;DNA提取試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司;制備DNA量子點的單鏈DNA（序列：5′-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT AAA AAA AAC CCC CCC CCC CCC C-3'）[20]，探針鏈接適配體（序列：SH-5′-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT-3′），磁珠連接適配體（序列：5′-GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-biotin-3′），以上所有DNA序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 主要儀器

原子力顯微鏡（AFM）：MultiMode-8，德國Bruker;透射電鏡（TEM）：JEM-2010，日本JEOL;紫外可見吸收光譜儀：750s，美國PerkinElmer;熒光光譜儀：FluoroMax-4，法國HORIBA;傅里葉紅外光譜儀（FTIR）：Nicolet iS50，美國Thermo;X射線光電子能譜（XPS）：VG Multilab 2000X，美國Thermal Electron;激光動態(tài)光散射儀（DLS）：Nano ZS90，英國Malvern。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA-QDs的制備

首先，將500μg單鏈DNA粉末（序列為：5′-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT AAA AAA AAC CCC CCC CCC CCC C-3′）裝在小離心管中，使用離心機在4000r/min下離心3min，待DNA粉末充分沉降在離心管底部后輕輕打開蓋子，加入500μL體積的超純水使其充分溶解，得到的DNA溶液濃度最終為1 mg mL-1。然后，將DNA溶液放入置有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，在加熱爐中進行水熱反應(yīng)，溫度恒定在110°C反應(yīng)10h。最后，將反應(yīng)后的溶液取出并在室溫下自然冷卻，無須進一步分離和純化即可得到粒徑均勻的DNA-QDs溶液。

1.3.2 AuNPs的制備

將小燒杯使用新鮮配制的王水進行仔細清洗，再使用超純水清洗干凈，確保其中沒有灰塵和雜質(zhì)。首先，向小燒杯中加入20mL超純水，再加入700μg的25000分子量的PEI，使溶液濃度為0.7mg mL-1，放置在磁力攪拌器上充分攪拌混勻。然后，向上述溶液中快速滴入HAuCl4（4mg mL-1， 2mL）溶液，封口后在室溫下持續(xù)攪拌24h即可得到粒徑均一的AuNPs-PEI溶液。

1.3.3 AuNPs-PEI/DNA-QDs復(fù)合熒光探針的合成

將1mL濃度為1mg mL-1的DNA-QDs溶液快速加入1mL濃度為1mg mL-1的AuNPs-PEI溶液，渦旋30s后在室溫下靜置20min，置于4℃下備用。

1.3.4 適配體修飾探針的制備

將2μL濃度為1.0×10-5mol L-1的鼠傷寒沙門氏菌適配體（序列為：SH-5′-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT-3′）溶液加入2mL的濃度為1mg mL-1的DNA-QDs/AuNPs探針并充分混合，在37℃下靜置24h。然后，將上述混合溶液離心后重懸于2mL含有1%BSA的PBS（10mM，pH7.4）溶液中，置于4℃下備用。

1.3.5 適配體修飾磁珠的制備

取1mL濃度為5mg mL-1的氨基化的磁性納米粒子（200-300nm）溶液，加入2mL含有5%戊二醛的PBS溶液中，在室溫下處理4h。在外置磁場下利用磁分離技術(shù)，使用PBS溶液清洗3次后重懸于1mL的PBS溶液中。加入1mL濃度為0.3mg mL-1的親和素，室溫下靜置4h后使用PBS溶液清洗3次后重懸于1mL的PBS溶液中，保存于4℃下備用。取0.5mL上述溶液，加入0.5mL濃度為1.0×10-8mol L-1的適配體（序列為：5′-GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-biotin-3′）溶液，置于37℃下靜置2h，利用磁分離技術(shù)使用PBS溶液清洗3次后置于4℃下備用。

1.3.6 沙門氏菌DNA的檢測

首先，將沙門氏菌DNA（序列為：5′-TAT CGT CGG TAA GGC ACG CTC AAT TGT CGT TAA AGT CCT GTT ATT TCC TGC GTG GAT AT-3'）溶液按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的數(shù)量級濃度分別進行稀釋。然后，分別取200μL的沙門氏菌DNA溶液與200μL的熒光探針溶液和200μL的磁珠溶液混合，在42℃下靜置2h后利用磁分離技術(shù)使用PBS溶液清洗3次。最后，使用PBS溶液重懸后使用熒光光譜儀進行檢測，同時計算出沙門氏菌DNA濃度與熒光強度間的線性關(guān)系。

1.3.7 對牛奶樣品中沙門氏菌DNA的檢測

以超市購買的包裝牛奶為實際檢測樣本，使用本研究中設(shè)計制備的熒光探針對其中沙門氏菌DNA進行檢測，驗證探針的準確性和實用性。首先，根據(jù)國家標準平板計數(shù)法測得沙門氏菌溶液的濃度，并按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的梯度濃度分別稀釋細菌溶液。然后，分別將不同濃度的沙門氏菌溶液添加入所購買的牛奶樣品當中，使用DNA提取試劑盒提取沙門氏細菌的DNA。最后，按照1.3.6中所敘述的方法檢測提取后的DNA溶液，并根據(jù)沙門氏菌DNA濃度與熒光強度間的線性關(guān)系確定其熒光強度，以此來驗證本方法的準確性和可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA-QDs的表征

利用透射電鏡觀察DNA量子點的形態(tài)及大小，從圖1中DNA量子點的TEM圖可以觀察到，DNA量子點是呈圓球形均勻分散的顆粒，其平均粒徑為1.6nm，這也與其AFM圖的結(jié)果相符。DNA量子點的光學性質(zhì)分別使用紫外可見吸收光譜儀和熒光光譜儀進行檢測，可以發(fā)現(xiàn)其紫外吸收峰在265nm，同時在不同激發(fā)波長下，DNA量子點的熒光發(fā)射光譜有所不同，從圖1中得知，在360nm的激發(fā)光下，其最大發(fā)射波長為440nm附近。

2.2 DNA-QDs的結(jié)構(gòu)分析

使用傅立葉紅外光譜儀對DNA量子點進行檢測，由圖2中DNA量子點的紅外光譜圖能夠觀察到，DNA量子點和DNA分別在3454、2925、1633、1384和1116cm-1處有明顯的紅外光譜吸收峰。另外，使用X射線光電子能譜儀通過寬波段的XPS掃描對分析，可以發(fā)現(xiàn)分別在133（P2p）、284（C1s）、399（N1s）和531（O1s）eV處的四個典型峰值，證明DNA量子點的組成結(jié)構(gòu)與DNA相似。綜合以上結(jié)果，表明本研究所制備的DNA量子點基本保持了DNA原有的分子結(jié)構(gòu)和生物相容性，其堿基結(jié)構(gòu)和主鏈上的PO4-1基團都被很好地保留下來。

2.3 AuNPs的表征

通過透射電鏡拍攝，由AuNPs的TEM圖像中觀察到，這些球形和分散良好的金納米粒子的平均粒徑大約為9nm。利用激光動態(tài)光散射儀測量AuNPs的尺寸分布，結(jié)果如圖3中顯示，AuNPs的分散系數(shù)為0.325，粒徑分布在9nm左右，這與TEM的結(jié)果一致。

2.4 AuNPs-PEI/DNA-QDs的表征

從圖4中可以看到，透射電鏡圖和動態(tài)光散射掃描結(jié)果清楚地揭示了DNA量子點與AuNPs之間復(fù)合結(jié)構(gòu)的形成。從TEM圖中觀察到，復(fù)合DNA量子點后的AuNPs平均粒徑由9nm變化到了11nm。同時，通過分析Zeta電位的變化可以知道，AuNPs在與DNA-QDs混合后，雖然仍保持著正電位，但AuNPs的zeta電位值發(fā)生了顯著變化。從圖中可以看到DNA-QDs/AuNPs探針的Zeta電位出現(xiàn)了兩個顯著的峰值，推測可能是由于AuNPs對DNA-QDs的不平衡吸附造成的。此外，將DNA-QDs和AuNPs混合后離心，用紫外可見吸收光譜儀和熒光光譜儀分別檢測所分離得到的上清液的光學性質(zhì)。圖4中顯示，上清液和DNA-QDs的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜進一步驗證了AuNPs對DNA-QDs的吸附與結(jié)合。

2.5 復(fù)合探針對沙門氏菌DNA的檢測

使用復(fù)合探針對鼠傷寒沙門氏菌的DNA進行測定，通過繪制細菌DNA濃度的對數(shù)曲線，可以發(fā)現(xiàn)沙門氏菌DNA濃度與其響應(yīng)熒光強度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9926。線性關(guān)系以方程式表示為Y=0.753X+4.393，其中Y和X分別表示激發(fā)波長360nm處的熒光強度和細菌DNA濃度在5fmol L-1到5.0×103fmol L-1之間的對數(shù)。用公式D=3N/S計算檢測限的結(jié)果為7.5fmol L-1，其中N和S分別為空白樣本信號的標準差和標準曲線的斜率。

2.6 使用復(fù)合探針對牛奶樣品的檢測結(jié)果

按照食品安全標準的要求，食品中如被檢測出含有沙門氏菌是不能被食用的，為了驗證本熒光探針的靈敏度和穩(wěn)定性，使用從超市購買的牛奶為實際檢測樣本，在人為添加不同稀釋濃度（10-1，10-2， 10-3，10-4，10-5，10-6，10-7）的沙門氏菌后用商品試劑盒提取其中的DNA，對其中沙門氏菌DNA進行檢測。當稀釋濃度為10-6時，已無法檢測到熒光信號。因此，將稀釋濃度為10-5的溶液再按照1倍、2倍、3倍、5倍稀釋后進行檢測，當稀釋2倍時已無法檢測到熒光信號。將稀釋1倍后的熒光強度值代入2.5中的方程式進行計算，計算出檢測限的結(jié)果為3.5fmol L-1。

3 結(jié)論

本研究首次利用AuNPs和DNA-QDs構(gòu)建了一種新型的自組裝核-殼結(jié)構(gòu)熒光探針，用于檢測傷寒沙門氏菌。PEI包被的AuNPs可以簡化應(yīng)用適配體修飾探針的繁瑣過程，并通過靜電吸附大量DNA-QDs來放大熒光信號。復(fù)合熒光探針在5fmol L-1到5.0×103 fmol L-1的范圍內(nèi)，沙門氏菌DNA濃度與其響應(yīng)熒光強度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9926，方程式表示為Y=0.753X +4.393，檢測限為7.5fmol L-1，可以有效地檢測傷寒沙門氏菌DNA。同時，本探針在實際牛奶樣品的檢測中計算出檢測限的結(jié)果為3.5fmol L-1，體現(xiàn)出了更好的準確性和穩(wěn)定性，達到了靈敏檢測的目的。

構(gòu)成熒光探針的兩種材料價格低廉、容易獲取，一般技術(shù)人員只需簡單操作，即可在短時間內(nèi)完成整個檢測過程。另外，本研究中所制備的熒光探針可以一次性制備后分多次使用，從而節(jié)省了反復(fù)制備的時間、減少了檢測成本，并且這種新型探針還具有檢測其他細菌和小分子的潛力，在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)療診斷和生物傳感器等領(lǐng)域可能有著更廣闊的應(yīng)用前景。

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