黑斑蛙腐皮病病原分離、鑒定及致病性研究

李成偉 王均 蘇航 耿毅

摘要：為了解黑斑蛙養(yǎng)殖場(chǎng)大規(guī)模暴發(fā)腐皮病的病原，從患病蛙肝臟中分離獲得1株革蘭氏陰性桿菌（編號(hào)：QW），對(duì)其培養(yǎng)特性、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因檢測(cè)、致病性及藥物敏感性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，菌株QW表型特征和理化特性與洛菲不動(dòng)桿菌相似，16S rRNA和gyrB基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上與洛菲不動(dòng)桿菌聚集為一族，最終判定該菌為洛菲不動(dòng)桿菌，是黑斑蛙上的一種新病原;致病性研究表明，該菌能夠通過浸泡的方式感染黑斑蛙，具有較強(qiáng)的致病性，發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為皮膚潰爛和內(nèi)臟器官出血，與自然發(fā)病癥狀一致;藥敏試驗(yàn)表明，洛菲不動(dòng)桿菌僅對(duì)四環(huán)素、氧氟沙星和氟苯尼考3種抗生素敏感。本研究鑒定出引起黑斑蛙腐皮病的病原為洛菲不動(dòng)桿菌，并對(duì)其致病性進(jìn)行研究，同時(shí)檢測(cè)了其藥物敏感范圍，為該病臨床防治用藥提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黑斑蛙;洛菲不動(dòng)桿菌;分離鑒定;致病性;藥物敏感

中圖分類號(hào)：S947.2 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0174-05

黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）屬無尾目蛙科側(cè)褶蛙屬，在我國(guó)華北、華中、華南地區(qū)的平原和丘陵分布較廣泛，也是我國(guó)近年來養(yǎng)殖蛙類中的主要品種之一。由于該品種是近年來擴(kuò)大的養(yǎng)殖規(guī)模[1]，相對(duì)于其他傳統(tǒng)養(yǎng)殖蛙類如牛蛙、虎紋蛙、美國(guó)青蛙的規(guī)模化養(yǎng)殖歷程較短，疾病研究相對(duì)較少，發(fā)病后只能參考其他蛙類疾病進(jìn)行比較處理，但水生動(dòng)物不同種屬間具有同病不同癥、同癥不同病的特征。如牛蛙、虎紋蛙上常見的白內(nèi)障、歪脖子疾病，這此疾病已報(bào)道的病原有氣單胞菌、腦膜敗血伊麗莎白菌、淺黃假單胞菌等[2-3]，而在黑斑蛙上的相同癥狀，病原卻出現(xiàn)了肺炎克雷伯菌[4]。因此，應(yīng)對(duì)不同品種、病原進(jìn)一步區(qū)分研究。對(duì)于蛙類的腐皮癥，已報(bào)道的有牛蛙和棘胸蛙由奇異變形桿菌感染引起[5-6]，但黑斑蛙的腐皮病未見相關(guān)報(bào)道。2019年6月，四川省內(nèi)江市某黑斑蛙養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)黑斑蛙大面積死亡，主要表現(xiàn)為頭部、背部及四肢出現(xiàn)不同程度的腐爛，剖解可見肝臟腫大、腎臟及肺部出血。本研究對(duì)其病原進(jìn)行分離，并通過病原菌的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA和gyrB基因測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行鑒定，確定該病原菌的種屬地位;然后通過人工感染試驗(yàn)確定該病原菌的致病性;最后通過藥物敏感試驗(yàn)分析該病原菌的藥物敏感范圍，旨在為該病的臨床防治用藥提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象

四川省內(nèi)江市某黑斑蛙養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病黑斑蛙（25～50 g）頭部、背部及四肢出現(xiàn)不同程度腐爛，剖解可見肝臟腫大出血、腎臟及肺部出血。采集患病典型的黑斑蛙進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌接種;健康黑斑蛙采集于另一黑斑蛙養(yǎng)殖場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)15 d確定健康無病后用于人工感染試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

牛腦心浸液培養(yǎng)基（BHI，美國(guó)BD公司），細(xì)菌生化微量鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司），PCR所用試劑、特異性引物及細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），藥敏試驗(yàn)紙片（杭州微生物試劑有限公司）。

1.3 病原菌的分離

無菌操作接種患病黑斑蛙的肝、脾、腎臟組織劃線于BHI培養(yǎng)基上，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后挑取顏色、大小、形態(tài)特征基本一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)一步培養(yǎng)。純化后再轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離菌株形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

將純化后的細(xì)菌接種至BHI瓊脂平板，于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)大小，同時(shí)對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。挑取單個(gè)菌落接種于微量生化管中，28 ℃下培養(yǎng)24～48 h，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[8]進(jìn)行生理生化特性鑒定。

1.5 16S rRNA和gyrB基因擴(kuò)增及序列測(cè)定

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA作為PCR模板。采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

將分離菌株的16S rRNA基因序列和gyrB基因擴(kuò)增序列與GenBank中已知核酸序列進(jìn)行Blast分析，調(diào)出與該序列相關(guān)性較高的核酸序列，用MEGA 6.0軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)抽樣1 000次分析系統(tǒng)樹各分枝的置信度。

1.6 人工感染試驗(yàn)

將復(fù)壯后的菌株接種到BHI肉湯培養(yǎng)基中，在28 ℃，120 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后，革蘭氏染色檢驗(yàn)純度。采用生理鹽水調(diào)整細(xì)菌濃度至3.0×108、3.0×107、3.0×106 CFU/mL，將1 L菌液加入黑斑蛙養(yǎng)殖桶中浸泡，對(duì)照組加入等量的生理鹽水，每組20只黑斑蛙。連續(xù)觀察14 d，記錄黑斑蛙發(fā)病情況和死亡情況，并分離病原進(jìn)行鑒定。

1.7 藥物敏感試驗(yàn)

采用藥敏紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用氨芐西林、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、阿齊霉素、克拉霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、制霉菌素、恩諾沙星、丁胺卡那、諾氟沙星、氧氟沙星、多粘菌素B、氟苯尼考17種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及生理生化特性

從患病黑斑蛙的肝臟分離得到1株高純度的優(yōu)勢(shì)菌株（編號(hào)：QW），其菌落狀態(tài)是灰白色、表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊、透明、涂片染色鏡檢可見革蘭氏陰性短桿菌（圖1），生化反應(yīng)結(jié)果見表1。

2.2 分離菌株的鑒定

以分離菌株QW的DNA為模板，采用細(xì)菌16S rRNA和gyrB基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)和凝膠成像系統(tǒng)后，16S rRNA基因于1 500 bp 左右得到目的條帶（圖2-a），gyrB基因于 1 200 bp 左右得到目的條帶（圖2-b）。經(jīng)測(cè)序得到16S rRNA序列1 409 bp（genbank登陸號(hào)：MN396229），gyrB基因1 113 bp（genbank登陸號(hào)：MN504787）。

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，在16S rRNA序列、gyrB基因序列上，菌株QW上都分別聚在洛菲不動(dòng)桿菌（Acinetobacter lwoffii）的分支上（圖3、圖4）。結(jié)合生理生化結(jié)果，將菌株QW判定為洛菲不動(dòng)桿菌。

2.3 人工感染試驗(yàn)

人工浸泡感染連續(xù)觀察14 d，試驗(yàn)結(jié)果見表2，隨著浸泡菌液濃度的增大，黑斑蛙的死亡率隨之升高，同時(shí)病癥周期加快，表現(xiàn)出背部、腿部表皮潰爛（圖5-a），肝臟腫大，腎臟、肺部出血（圖 5-b），與自然發(fā)病癥狀相似，推測(cè)洛菲不動(dòng)桿菌是該病的主要病原，且對(duì)黑斑蛙致病性較強(qiáng)。

2.4 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，對(duì)菌株QW進(jìn)行17種藥物敏感性試驗(yàn)。由表3可知，QW菌株僅對(duì)四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考3種抗生素敏感;而對(duì)慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、丁胺卡那4種抗生素介于敏感與耐藥之間;其余的10種均為耐藥。

3 討論

洛菲不動(dòng)桿菌是一種可利用環(huán)境中多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為自身能量來源的需氧型革蘭氏陰性菌，因其適應(yīng)性強(qiáng)，普遍存在于土壤、水及干燥環(huán)境中，且是一種對(duì)多種抗生素具有抗性的細(xì)菌，一直以來是醫(yī)院感染常見的一種條件性致病菌[9]。洛菲不動(dòng)桿菌感染包括菌血癥、繼發(fā)性腦膜炎、尿路感染、手術(shù)部位感染、胃炎和肺炎，特別是在重癥監(jiān)護(hù)室中[10]。在養(yǎng)殖業(yè)中，洛菲不動(dòng)桿菌能廣泛引起養(yǎng)殖動(dòng)物感染，感染包括奶牛子宮內(nèi)膜炎[11]、仔豬肺部感染[12]、禽類呼吸道感染[13]等，水生動(dòng)物感染相對(duì)較少，感染鯉魚[14]、虹鱒[15]、草魚[16]，主要表現(xiàn)為敗血癥、胡子鲇“吊頭病”[17]等， 兩棲動(dòng)物感染的美國(guó)青蛙“抽搐癥”[18]、牛蛙腹水病[19]。本試驗(yàn)表明，洛菲不動(dòng)桿菌感染黑斑蛙后，主要表現(xiàn)為腐皮和肝臟腫大出血、腎臟出血、肺出血，這與洛菲不動(dòng)桿菌感染牛蛙癥狀相似[19]，感染后黑斑蛙表皮輕微腐爛、肝臟腫大充血，但未出現(xiàn)美國(guó)青蛙和牛蛙的腹水、肝臟白色結(jié)節(jié)、腿部充出血斑，證明不同環(huán)境、不同種屬動(dòng)物感染間存在一定差異。

水產(chǎn)動(dòng)物中細(xì)菌性疾病的治療最常用且有效的方法為內(nèi)服抗生素，而抗生素的準(zhǔn)確使用需要以藥敏試驗(yàn)結(jié)果作為依據(jù)[20]。相關(guān)研究表明，在人醫(yī)領(lǐng)域洛菲不動(dòng)桿菌不同地域分離株的耐藥性不同，但大部分菌株對(duì)青霉素、頭孢類、復(fù)方新諾明表現(xiàn)出強(qiáng)耐藥性，對(duì)阿米卡星、亞胺硫霉素、美羅培南敏感[21]，但除阿米卡星不能獸用且存在多重耐藥、耐藥率上升較快外，洛菲不動(dòng)桿菌已成為“超級(jí)耐藥菌的潛在菌群”[22]。近幾年，在水生動(dòng)物上分離的洛菲不動(dòng)桿菌對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等存在多重耐藥性[15]。本研究分析了洛菲不動(dòng)桿菌對(duì)17種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示，菌株僅對(duì)四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考3種藥物敏感，對(duì)慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、丁胺卡那4種抗生素介于敏感與耐藥之間，其余的10種均為耐藥，說明洛菲不動(dòng)桿菌具有較強(qiáng)的耐藥性，因此建議臨床治療不能盲目使用抗生素。首先通過改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高動(dòng)物自身免疫力，調(diào)節(jié)水環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)等措施來預(yù)防該疾病，發(fā)病后需要科學(xué)診斷，在藥物敏感試驗(yàn)指導(dǎo)下科學(xué)用藥。

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