超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑及其代謝物CCIM的殘留量

周悅 孫慧 李欣 王遠(yuǎn) 王洪慶 龍?bào)@驚 丁琦 張璋

摘要：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑及其代謝物CCIM的含量，樣品經(jīng)含0.1%乙酸的乙腈溶液振蕩提取，離心過濾后上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，唑菌酮在0.002 0 mg/L～0.100 0 mg/L的濃度之間線性關(guān)系良好，r2≥0.998 6;氰霜唑及其代謝物CCIM在0.000 2 mg/L～0.010 0 mg/L的濃度之間線性關(guān)系良好，r2≥0.996 8。上述農(nóng)藥在馬鈴薯中的平均回收率在76.4%～95.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.91%～5.62%之間，定量限在0.01～0.02 mg/kg之間。該方法簡單、快速、準(zhǔn)確性好、靈敏度高，能夠滿足馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑及其代謝物CCIM殘留量的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：唑菌酮;氰霜唑;CCIM;馬鈴薯;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號(hào)： S482.2;S481+.8 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0206-04

唑菌酮是一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，對(duì)防治各種霜霉病、黑斑病、晚疫病效果顯著[1-3]。氰霜唑是一種新型環(huán)境保護(hù)型的苯并磺胺咪唑類殺菌劑，對(duì)疫霉菌、腐霉菌等卵菌綱病原菌具有很高的活性[4-5]。由于氰霜唑在與其他殺菌劑共同施用時(shí)，具有無交叉抗性的特點(diǎn)，可以與唑菌酮制成混劑，這種混劑對(duì)于治療馬鈴薯晚疫病和霜霉病效果顯著[6]。在2014—2018年間，唑菌酮和氰霜唑分別作為有效成分以不同劑型在我國馬鈴薯病蟲草害防治上登記的數(shù)量分別為7、23個(gè)[7]。然而，氰霜唑在使用后會(huì)迅速分解成4-氯-5-（4-甲苯基）-1H-咪唑-2-腈（CCIM）、4-氯-5-（4- 甲苯基）-1H-咪唑-2-羧酸（CCTA）、4-氯-5（4-甲苯基）-1H-咪唑-2-甲酰胺（CCIM-AM）等多個(gè)代謝產(chǎn)物。其中CCIM作為主要降解產(chǎn)物，比氰霜唑具有更高的毒性[5]。

目前，國內(nèi)外尚未有文獻(xiàn)報(bào)道能同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑、CCIM殘留量的分析方法。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法建立同時(shí)測(cè)定馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑及其代謝物CCIM含量的分析方法。在樣品前處理過程中，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)、對(duì)比回收率，確立馬鈴薯樣品用含0.1%乙酸的乙腈振蕩提取，離心過濾后直接經(jīng)UPLC-MS/MS檢測(cè)的方法，較傳統(tǒng)QuEChERS方法更加簡捷、經(jīng)濟(jì)、高效。本研究方法在覆蓋2個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍內(nèi)[8]，線性關(guān)系良好，并得到較高的準(zhǔn)確度和精密度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要的試驗(yàn)儀器有PerkinElmer Qsight超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（珀金埃爾默儀器有限公司）、梅特勒-托利多PB-10pH計(jì)、梅特勒-托利多XS205DU型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、美的WBL25B36榨汁機(jī)（美的公司）、Sigma 3K15高速冷凍離心機(jī)（日本Sigma公司）、ZWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

主要的試驗(yàn)試劑有哇哈哈純凈水，甲醇、乙腈（色譜級(jí)，美國Fisher公司），甲酸（色譜級(jí)，Acros Organics公司），乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：氰霜唑、CCIM、唑菌酮[國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（沈陽）]，N-丙基乙二胺（PSA）固相吸附劑40～60 μm、C18凈化劑（Agela Technologies）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)乙腈逐級(jí)稀釋，配制成100、10、1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，將濃度為1 mg/L的儲(chǔ)備液分別用乙腈（含0.1%乙酸）和空白基質(zhì)稀釋，唑菌酮配制成0.002 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100 0 mg/L系列濃度的工作溶液;氰霜唑和CCIM配制成 0.000 2、0.000 5、0.001 0、0.002 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0 mg/L系列濃度的混合工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 采用改進(jìn)后的QuEChERS方法：稱取（10±0.05） g經(jīng)榨汁機(jī)攪碎后的馬鈴薯樣品置于三角瓶中，加入50 mL乙腈（含1%乙酸），180 r/min 振蕩30 min后，加入6 g氯化鈉振蕩 2 min，鹽析，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取2.0 mL上層清液直接過3次0.22 μm的有機(jī)系濾膜，UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.2.3 儀器條件 色譜條件：色譜柱Phenomenex Kinetex 2.6 μm，C18（100 mm×4.6 mm），柱溫為 40 ℃，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相為A相：水（含0.1%甲酸），B相：乙腈。洗脫條件見表1。

質(zhì)譜條件：采用ESI電噴霧離子源，正離子模式，三重四級(jí)桿質(zhì)量檢測(cè)器。離子化電壓為 5 800 V，離子源溫度為400 ℃，反吹干燥器流速為100 μL/min，霧化氣流速為180 μL/min，質(zhì)譜接口加熱溫度HSID為300 ℃，真空室入口電壓為10 V，利用質(zhì)譜自帶的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，簡稱MRM）優(yōu)化功能，獲得不同離子對(duì)的碰撞室入口電壓和碰撞能2個(gè)參數(shù)。3種農(nóng)藥的定性/定量離子對(duì)如表2。

1.2.4 測(cè)定方法 按“1.2.3”節(jié)的儀器條件，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針峰面積相對(duì)變化小于1.5%后，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線、測(cè)試樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線的順序進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，作溶劑空白和基質(zhì)空白對(duì)照，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行外標(biāo)定量，色譜結(jié)果如圖1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯樣品前處理方法的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇 分別選取乙腈、甲醇、乙腈+0.1%乙酸、甲醇+0.1%乙酸等4種溶劑進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)采用甲醇、甲醇+0.1%乙酸2種溶劑時(shí)，振蕩、鹽析后，分層不明顯，上層提取液混濁。采用乙腈作為提取溶劑時(shí)，氰霜唑、CCIM、唑菌酮的平均回收率分別為84.9%、87.2%、70.5%;用乙腈+0.1%乙酸作為提取溶劑，氰霜唑、CCIM、唑菌酮的平均回收率分別為88.4%、90.0%、76.2%，因此本研究選用乙腈+0.1%乙酸作為提取溶劑。

2.1.2 凈化劑的選擇 QuEChERS方法常用的凈化劑包括GCB、MgSO4、PSA、C18等吸附填料[9-11]，通常PSA用于去除極性的有機(jī)酸、一些糖類、脂類;MgSO4用于去除水分;GCB用于去除色素、如葉綠素，但對(duì)平面結(jié)構(gòu)藥物會(huì)有吸附;C18用于去除脂類和固醇、類胡蘿卜素等。本研究分別考察PSA和C18組合添加、單獨(dú)添加、不添加對(duì)回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSA和C18均對(duì)唑菌酮的回收率影響較大，回收率降低，懷疑與化合物分子結(jié)構(gòu)有關(guān)[12-15]。而當(dāng)不添加任何凈化劑時(shí)，氰霜唑、CCIM、唑菌酮均能得到較好的回收率，且目標(biāo)物并未受到基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，具體參見圖2至圖4。因此，本研究采用鹽析分層后，不經(jīng)凈化，采用直接過濾的方式進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)，此法更加經(jīng)濟(jì)、快捷、高效。

2.2 方法的線性相關(guān)性、基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

分別以唑菌酮、氰霜唑、CCIM標(biāo)液的質(zhì)量濃度（mg/L）對(duì)響應(yīng)值（峰面積）進(jìn)行線性回歸，采用1/x2加權(quán)， 得出線性回歸方程。基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)按照純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的順序進(jìn)行檢測(cè)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。其中，唑菌酮在純?nèi)軇┲械那€方程為y=553.760 00x-191.996 17，r2=0.998 7（n=6）;在馬鈴薯基質(zhì)中的曲線方程為y=467.000 00x-260.444 61，r2=0.998 6（n=6）;基質(zhì)效應(yīng) ME%=（553.76-467.00）/553.76×100%=15.67%;氰霜唑在純?nèi)軇┲械那€方程為y=9 930x-217，r2=0.999 2（n=7）;在馬鈴薯基質(zhì)中的曲線方程為y=8 715x-118，r2=0.996 8（n=7），基質(zhì)效應(yīng)ME%=（9 930-8 715）/8 715×100%=13.94%;代謝物CCIM在純?nèi)軇┲械那€方程為y=34 302x-15，r2=0.996 4; 在馬鈴薯基質(zhì)中的曲線方程為y=30 036x-216，r2=0.998 6;CCIM基質(zhì)效應(yīng)ME%=（34 302-30 036）/30 036×100%=14.20%。上述結(jié)果表明，3種農(nóng)藥在線性范圍內(nèi)，響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度之間線性關(guān)系良好，且未見明顯的基質(zhì)效應(yīng)。本研究采用基質(zhì)配制工作溶液。

2.3 添加回收率及重復(fù)性

本試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平作3組平行試驗(yàn)，相應(yīng)的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，簡稱RSD）結(jié)果如表3所示。由表3可知，3種農(nóng)藥平均回收率在76.4%～95.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.91%～5.62%之間。

2.4 方法的定量限

以最小添加濃度作為方法的定量限、唑菌酮在馬鈴薯中的LOQ為0.02 mg/kg;氰霜唑、CCIM在馬鈴薯中的LOQ為0.01 mg/kg。本試驗(yàn)所測(cè)溶劑空白、馬鈴薯空白樣品在目標(biāo)物出峰區(qū)間的信號(hào)均小于LOQ水平響應(yīng)的30%。

3 結(jié)論

本研究開發(fā)的方法，線性相關(guān)性、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性LOQ的檢測(cè)結(jié)果均達(dá)到指標(biāo)。該方法簡捷、高效，具有較高的靈敏度和良好的精密度等特點(diǎn)，能滿足國內(nèi)外相關(guān)農(nóng)藥最大殘留量的標(biāo)準(zhǔn)要求，適合推廣。

參考文獻(xiàn)：

[1]梁 林，李文平，劉 偉. 唑菌酮在馬鈴薯和土壤中的殘留分析方法及消解動(dòng)態(tài)研究[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理，2017，38（3）：34-37.

[2]李文燕，劉洪濤，龐國勛，等. 殺真菌劑唑菌酮的合成[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，40（6）：523-525.

[3]Sternberg J A，Geffken D，Adams J B，et al. Famoxadone：the discovery and optimisation of a new agricultural fungicide[J]. Pest Management Science，2001，57（2）：143-152.

[4]Camara A，Martinez G，Cermeno S，et al. Influence of fungicide residues and in vitro gastrointestinal digestion on total antioxidant capacity and phenolic fraction of Graciano and Tempranillo red wines[J]. Journal of Environmental Science and Health，Part B，2019，54（12）：942-947.

[5]Zhang P F，Guan A Y，Xia X L，et al. Design，synthesis，and structure-activity relationship of new arylpyrazole pyrimidine ether derivatives as fungicides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019，67（43）：11893-11900.

[6]李改云，梁慶豐. 64%唑菌酮·氰霜唑水分散粒劑的氣相色譜分析[J]. 世界農(nóng)藥，2017，39（6）：54-55，61.

[7]梁宏杰，呂和平，吳雁斌，等. 2014—2018年我國馬鈴薯病蟲草害防治農(nóng)藥登記現(xiàn)狀分析[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（8）：65-72.

[8]中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部. 農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則：NY/T 788—2018[S]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2018：5-8.

[9]Xian Z，Mobley N，Zhang J G，et al. Analysis of agricultural residues on tea using d-SPE sample preparation with GC-NCI-MS and UHPLC-MS/MS[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（22）：11553-11560.

[10]Pouech C，Tournier M，Quignot N，et al. Multi-residue analysis of free and conjugated hormones and endocrine disruptors in rat testis by QuEChERS-based extraction and LC-MS/MS[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2012，402（9）：2777-2788.

[11]Núez O，Gallart-Ayala H，F(xiàn)errer I，et al. Strategies for the multi-residue analysis of 100 pesticides by liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2012，1249（1）：164-180.

[12]陳士恒，史曉梅，呂岳文，等. QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法快速檢測(cè)番茄醬中19種常見農(nóng)藥殘留量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2015，6（4）：1128-1136.

[13]尹 怡，趙 城，余 權(quán)，等. 改良QuEChERS法與LC-MS/MS聯(lián)用測(cè)定水產(chǎn)品中13種農(nóng)藥殘留[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2019，19（11）：255-260.

[14]張愛娟，梁 林，馬新剛，等. 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)大白菜中氰霜唑及其代謝物和氟啶胺的殘留[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理，2018，39（11）：48-53.

[15]趙民娟，郭虹娜，邵 華，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃瓜與土壤中烯酰嗎啉和氰霜唑及其代謝物的殘留量[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2018，37（11）：1316-1321.