高效液相色譜-串聯質譜法檢測原桃膠中左旋肉堿的含量

劉啟月 李勇 余向陽 胡秋輝

摘要：利用超聲波輔助提取技術和高效液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）對原桃膠中的左旋肉堿進行定量分析。以左旋肉堿的含量為研究對象，考察不同提取劑的提取效率，優化左旋肉堿的液質聯用分析條件。結果表明，1 g原桃膠經80%甲醇于60 ℃、300 W超聲提取1 h處理的左旋肉堿得率最高;左旋肉堿在相應含量范圍內的線性良好，r2=0.995;左旋肉堿加標量為140～560 μg/kg時，回收率為89.7%～109.9%，相對標準偏差為1.4%～4.5%，方法定量限為15.1 pg。利用建立的分析方法測定6批桃膠樣品中的左旋肉堿，結果顯示，得率為 160～330 μg/kg。綜上可得，該方法可準確快速地對桃膠中的左旋肉堿進行定量分析。

關鍵詞：原桃膠;左旋肉堿;液質聯用;LC-MS/MS

中圖分類號： R284.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0215-04

桃膠別稱桃樹膠，是桃[Prunus persica （L.） Batsch]或山桃[Prunus davidiana（Carr.）Franch]等薔薇科植物樹干受到機械傷或致病后分泌出來的膠質半透明狀物質[1]在樹干上曬干或采用其他脫水方法獲得的淡黃色、黃褐色半透明的固體塊狀物質（圖1）。采摘后未經其他加工處理的桃膠為原桃膠，原桃膠味苦、性平、益氣、和血、止渴、活血消腫、通淋止痛[2]。古代早已記載，原桃膠具有治療消渴癥即糖尿病的作用[2-4]，現代研究也發現，原桃膠具有降血糖、降血脂、提高免疫力[5]、抗氧化[6]、抗菌[7]等功能。并不是所有的桃樹都能產生桃膠，一般新樹不產生桃膠，隨著樹齡的增長，樹枝上的干創口（生理或病理）增多，流膠開始變多。桃膠的產生與氣候有很大關系，在我國亞熱帶季風氣候區的沿海沿江地區，夏秋季桃膠的生產量較多，尤以湖北、浙江、福建、江蘇秦嶺-淮河以南地區盛產。盛產桃膠地區的居民常將桃膠作為一種食材烹飪成各種地方特色美食食用，例如用桃膠煲羹，有土家燕窩之稱，一度被很多愛美人士追捧。

左旋肉堿（L-carnitine），又稱L-肉堿、左卡尼汀、L-肉毒堿或維生素BT，是一種人類必需的類氨基酸，其主要的生理功能是作為載體將長鏈脂肪酸從線粒體膜外運輸到膜內，從而促進脂肪酸的 β-氧化，加速機體的脂肪代謝[8]。研究發現，適當增加人體內左旋肉堿的含量，可以促進脂酰基的轉運，從而促進脂肪代謝，降低各種組織的脂肪量，達到減脂、減體質量的目的[9]。左旋肉堿具有很好的保健作用，常作為食品中的營養強化劑、添加劑添加于嬰兒食品、運動員飲品、減肥健美食品中，還可以作為飼料添加劑促進動物生長[10]。人體內左旋肉堿的一個重要來源是從膳食中攝入，左旋肉堿在紅肉中的含量較多，在植物中的含量極少甚至沒有。目前，左旋肉堿的檢測方法主要有酶技術法、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法和質譜聯用法[11]，其中質譜聯用法操作方便，不需要衍生化，不存在衍生過程中的水解問題，并且液相色譜可以消除載體干擾因素，適合樣品中游離肉堿、總肉堿的測定[12]。

目前，對于原桃膠的研究主要集中在桃膠多糖成分的分析及其功能研究，對其他成分的研究基本沒有報道。原桃膠的營養價值不僅是因為其含有豐富的植物多糖，研究者在原桃膠中還發現了蛋白質、氨基酸及豐富的微量元素。筆者在試驗前期發現，原桃膠中可能還存在左旋肉堿。原桃膠中的左旋肉堿含量可能是評價原桃膠營養價值的重要指標。本研究以原桃膠為原料，優化提取條件及液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）檢測條件，對原桃膠中的左旋肉堿進行提取與定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1批原桃膠混合樣品采摘于湖北省武漢市，6批不同品種的原桃膠樣品于2019年6月采摘于浙江省杭州市;左旋肉堿標準品（純度為95.54%，購自上海安譜實驗科技股份有限公司）;超純水（儀器購自Direct-R公司）;甲酸、甲酸銨、甲醇、乙腈均為色譜純。

Agilent 1290-6470液相色譜質譜聯用儀，購自美國Agilent公司;SBL-10DT超聲波恒溫清洗劑，購自寧波新芝生物科技股份有限公司;TG16-WS型高速離心機，購自長沙湘智離心機儀器有限公司;粉碎機，購自天津泰斯特檢測有限公司;AP2500-0 型電子天平，產自瑞士Ohaus公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 左旋肉堿的提取方法 挑選100 g干凈的食用級原桃膠，經粉碎機粉碎60 s后，將桃膠粉過60目篩收集備用。取1 g桃膠粉于50 mL離心管中，加入30顆玻璃小珠（防止桃膠樣品結團，提高提取效率），加入10 mL提取液，在60 ℃溫水中于300 W超聲提取60 min，室溫冷卻至常溫后 5 000 r/min 離心5 min，取1 mL上清液，用 0.22 μm 的有機濾膜過濾到進樣小瓶中，待測。

1.2.2 標準液的制備 標準儲備液的配制：稱取10.0 mg左旋肉堿入10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后稀釋定容、混勻。配制的左旋肉堿標準儲備液質量濃度為1 mg/mL，可于-18 ℃保存6個月。

標準曲線的繪制：用甲醇將左旋肉堿標準儲備液逐級稀釋，得到質量濃度為10、20、40、60、80、100 μg/L 的標準液，根據測得的結果繪制標準曲線。

1.2.3 色譜條件 色譜柱Agilent poroshell 120 HILIC-Z（2.1 mm×150.0 mm，2.7 μm），Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150.0 mm，3.5 μm），流動相：80%乙腈-20%水（含20 mmol/L甲酸銨，用純度為99%的甲酸調節pH值為2.3），流速為 0.3 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為5 μL。

1.2.4 質譜條件 離子監測方式為多離子監測（MRM），離子化模式為正離子化方式，離子源為電噴霧（ESI），毛細管電壓為4.0 kV，霧化氣壓為103.4 kPa，干燥氣流速為11 L/min，干燥器溫度為350 ℃，定量離子對的質荷比（m/z）為162. 1→103.1，定性離子對的m/z為162.1→64.1，錐孔電壓為100 V，碰撞能量為14 V，左旋肉堿在3 min左右即出峰。

2 結果與分析

2.1 LC-MS儀器條件的優化

左旋肉堿為極性化合物，本研究分別考察C18色譜柱、HILIC色譜柱的分離效果，以80%乙腈-20%水（20 mmol/L甲酸銨，pH值為2.3）為流動相，由于左旋肉堿的極性強，C18柱峰型不佳且拖尾現象明顯，而HILIL柱對左旋肉堿的保留時間適中且峰形佳，適合定量分析。圖2-a為C18柱左旋肉堿的提取離子EIC圖，圖2-B為HILIC色譜柱左旋肉堿的提取離子EIC離子圖。左旋肉堿在電噴霧正離子化方式下主要生成[M+H]+（m/z：162.2），因此選擇[M+H]+進行產物離子掃描，產生的主要碎片離子m/z為103.1和64.0，將m/z為103.1的碎片離子作為定量離子，將m/z為64.0的碎片離子作為定性離子。整個檢測過程為5 min，出峰時間為 3 min 左右（圖2）。

2.2 樣品提取優化

考察用不同含水量的有機提取液提取桃膠中左旋肉堿的效率，取1 g混合樣桃膠粉末，加入 10 mL 提取液，提取液分別為體積分數為90%、80%、70%乙醇、甲醇和乙腈，按照“1.2.1”節的方法超聲提取1 h，取上清液，過濾后用LC-MS/MS測定其左旋肉堿含量。由圖3可以看出， 80%甲醇的提取得率為9種提取液中最好的（當甲醇含水量大于30%時，桃膠泡發成黏稠狀，無法分離上清）。因此，本研究選擇80%甲醇提取左旋肉堿。

2.3 左旋肉堿的回收率與檢出限

用80%甲醇按照“1.2.1”節的方法重復提取7份桃膠粉末，用LC-MS/MS測得左旋肉堿的均值為288 μg/kg，相對標準偏差（RSD）為4.9%。以288 μg/kg作為本底值，添加約0.5、1.0、2.0倍本底值的左旋肉堿標準物質到實際樣品中，進行回收率試驗，每個添加濃度平行重復5次。由表1可見，左旋肉堿的加標回收率為89.7%～109.9%，相對標準偏差為1.4%～4.5%。因此，本研究方法具有較好的回收率，能夠滿足實際樣品的分析要求。

取儲備液逐級稀釋，進樣量設為5 μL。以信噪比（S/N）=3計算左旋肉堿的檢出限（LOD），以信噪比=10計算其定量限（LOQ），并以標準品的質量進行計算。結果表明，左旋肉堿的LOD為 5.0 pg/g，LOQ為15.1 pg/g，能夠滿足實際樣品分析對檢測限的需求。

2.4 標準曲線與線性范圍

利用LC-MS/MS分析10、20、40、60、80、100 μg/L 系列標準溶液。以標準樣品的峰面積（y）為縱坐標、質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程為y=274.9x+815.8，r2=0.995。結果表明，在質量濃度為10～100 μg/L 范圍內時，左旋肉堿的線性關系良好。

2.5 精密度與重現性

分別對質量濃度為10、20、100 μg/L的標準溶液進行5次連續進樣，計算5次測定值的平均值和變異系數（CV），考察方法的精密度。由表2可見，針對不同濃度的左旋肉堿標準溶液進行連續進樣后，3個質量濃度水平的CV為1.0%～3.1%，表明該方法隨機誤差較小，具有較好的精密度。通過同一臺儀器、同一實驗員同一天對定值配方粉進行重復測定（n=7），考察方法的日內精密度;通過同一臺儀器、同一實驗員連續3 d對定值配方粉進行重復測定（n=7），考察方法的日間精密度。結果顯示，日內精密度和日間精密度良好，CV分別為3.2%和8.0%。

2.6 樣品含量的測定

取6月份采集于浙江省的6批不同品種的桃膠樣品，粉碎后分別準確稱取1 g，每個樣品設3個平行，分別按照“1.2.1”節的方法對桃膠中的左旋肉堿含量進行測定。如表3所示，經本研究方法對6批桃膠樣品進行定量分析，確定該6批原桃膠中的左旋肉堿含量為160～330 μg/kg。左旋肉堿在動物紅肉中含量豐富，在羊肉、牛肉中的含量較高，瑞士LONZA公司的數據顯示，綿羊肉中的左旋肉堿含量達到2 100 mg/kg，牛肉中的含量為640 mg/kg，雞肉中的含量為75 mg/kg。目前的研究結果顯示，左旋肉堿在植物中含量很少或基本沒有，在椰菜花、花生中的含量為1 mg/kg，橄欖、橙汁、菠菜葉中未檢出左旋肉堿。原桃膠中左旋肉堿的含量尚達不到GB 14880—2012《食品安全國家標準——食品營養強化劑使用標準》[13]中的含量范圍，但其作為一種膳食兼備的天然植物源產品，還是含有一定量的左旋肉堿。原桃膠中不只含有桃膠多糖，研究原桃膠中的其他具體功能活性成分，可為后期桃膠功能型產品的開發與加工提供指導性建議。

3 結論

本研究利用超聲波輔助提取技術和高效液相色譜-串聯質譜儀對原桃膠中的左旋肉堿進行定量分析。結果顯示，1 g原桃膠經80%甲醇于 60 ℃、300 W超聲提取1 h所得左旋肉堿得率最高。左旋肉堿在相應含量范圍內的線性良好，r2=0.995，加標回收率和檢測限定量限均滿足要求。利用本研究建立的分析方法，測得6批桃膠樣品中左旋肉堿的得率為160～330 μg/kg。

目前，評價桃膠的品質標準并不完善，還需從多方面做更詳細的研究。一方面是應加大對其含量最多的桃膠多糖的生理作用機制的研究;另一方面，應加大對除桃膠多糖外其余的生理活性成分的定性定量研究;最后，桃膠作為采后可直接食用的食材，農藥殘留風險也是需要關注的重點。由此看出，原桃膠的價值研究需要投入更多關注。

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