多菌靈降解菌djl-6和啶蟲脒降解菌D-2液體菌劑的研發

徐銘陽 盧家森 耿翔 劉卜郡 何健 黃星

摘要：以長期受多菌靈和啶蟲脒農藥污染的土壤中分離篩選得到的多菌靈降解菌株慶笙紅球菌（Rhodococcus qingshengii sp. nov. ）djl-6和啶蟲脒降解菌株噬染料菌（Pigmentiphaga sp. ）D-2為供試菌株，研究了降解菌菌劑的不同保存劑型與初步應用的情況。結果表明，2株降解菌均以苯甲酸鈉作為防腐劑的處理效果最好，能維持活菌數較高且不產生雜菌污染。降解菌djl-6復配保護劑的最佳使用濃度：0.30%檸檬酸鈉、0.30%羧甲基纖維素、0.20% CaCl2。降解菌D-2復配保護劑的最佳使用濃度：0.20%糊精、0.20%檸檬酸鈉、0.30% CaCl2。與對照相比，添加保護劑后，菌株djl-6、菌株D-2活菌數分別夠提高32.03%、38.70%。2株菌的液體菌劑保存45 d后，降解菌djl-6能夠在10 d內將土壤5 mg/kg多菌靈降解95.23%，降解菌D-2能夠在10 d內將土壤5 mg/kg啶蟲脒降解92.75%，有效延長了液體菌劑的保存期。

關鍵詞：多菌靈降解菌;啶蟲脒降解菌;液體菌劑;保存條件

中圖分類號： X172 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0270-06

設施農業作為農業現代化發展的重要產業越來越受到各國政府的重視，設施農業不僅有效解決了我國淡季期間蔬菜短缺問題，還促進了居民傳統消費結構的改變[1]。但是設施農業中蔬菜病蟲害較多，農藥的使用率也相對較高，以多菌靈和啶蟲脒為代表的農藥因其高效低毒的特點[2-4]而被廣泛應用于設施農業之中。多菌靈是一種內吸性的廣譜殺菌劑，土壤中殘留的多菌靈會導致土壤微生物數量下降，抑制土壤脫氫酶、磷酸酶活性[5-6]。啶蟲脒是一種內吸殺蟲劑，殘留在土壤中會抑制土壤固氮菌、放線菌活性，對土壤動物產生慢性毒性[7-8]。

應用微生物修復農藥殘留污染是一種公認的安全有效的方法。目前，我國農藥殘留相關研究主要集中在高效降解菌株的篩選和培育上，在微生物菌劑的開發應用方面的研究仍然不夠完善[9-11]。微生物作為一種活體生物，其保存情況極易受到外界環境的影響，微生物液體菌劑的儲存一直是阻礙降解菌菌劑的大規模應用的難題，而目前關于微生物液體菌劑保存條件的研究非常少[12-14]。筆者所在實驗室分離并保藏了多菌靈、啶蟲脒降解菌株，其中多菌靈降解菌株能在7 d內將5 mg/kg多菌靈降解80.0%，啶蟲脒降解菌株在5 d內將 10 mg/kg 啶蟲脒降解90.0%。由于液體菌劑中的微生物易受周圍環境影響從而導致菌劑保存期短，本研究首先篩選出了2個菌株的液體菌劑防腐劑及其使用濃度，研究了菌劑不同保藏條件對其活菌數以及降解率的影響，以期為農藥降解菌菌劑的保存與應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

多菌靈原藥購自江蘇省新沂農藥有限公司（純度99.8%）。啶蟲脒原藥購自綠源制藥集團（純度98.3%）。無機鹽培養基：硝酸銨1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH值7.0。

LB培養基：酵母浸出物5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，超純水1 L，pH值7.0，固體培養基加入1.5%～2.0%的瓊脂。

D-2發酵培養基：葡萄糖9 g/L，硫酸銨 0.9 g/L，酵母膏0.3 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣 1 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH值7.0～7.2。

djl-6發酵培養基：葡萄糖8 g/L，硫酸銨 0.8 g/L，酵母膏0.2 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2 供試菌株、供試作物與土壤

多菌靈降解菌株慶笙紅球菌（Rhodococcus qingshengii sp. nov. ）djl-6，啶蟲脒降解菌株噬染料菌（Pigmentiphaga sp. ）D-2，均由筆者所在實驗室分離并保藏。

供試青菜品種為上海青，購自南陽青青種業。

供試土壤為黃棕壤，采集于南京農業大學牌樓試驗基地。

1.3 液體菌劑防腐劑的篩選

1.3.1 防腐劑的初篩 設置菌株djl-6、菌株D-2這2組處理，每組處理取12個已滅菌的500 mL三角瓶（共24個）。每種菌設置4個防腐劑添加處理，依次為丙酸鈣、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、不添加試劑（CK），每個處理3個平行，共12個。每個處理依次加入相應的已發酵的菌株發酵液300 mL和添加量為發酵液的0.50%（1.5 mL）的防腐劑，CK為不添加防腐劑的對照組，添加等體積（1.5 mL）的無菌水。用封口膜封緊，置于常溫條件下避光保存。放置3 d后，取樣，采用稀釋涂布平板法對菌株djl-6、菌株D-2以及雜菌進行計數，并計算雜菌率[15-16]。

1.3.2 防腐劑的復篩 根據防腐劑的初篩結果，分別向菌株djl-6和菌株D-2發酵液中添加苯甲酸鈉作為防腐劑，添加量分別為發酵液的0.10%、0.30%、0.50%、0.70%、1.00%，同時設置不添加苯甲酸鈉的對照，后續操作同“1.3.1”節。

1.4 液體菌劑保護劑的篩選

1.4.1 單因子保護劑的篩選 分別挑取菌株djl-6、菌株D-2的單菌落于LB液體培養基中，放置于30 ℃搖床中160 r/min培養至對數生長期，以1%接種量接入到盛有500 mL液體發酵培養基的三角瓶中繼續培養至對數生長期。在無菌條件下裝入已高溫滅菌的50 mL無菌管中，再分別加入預先初篩過的氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、糊精、黃腐酸、羧甲基纖維素、甲酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉試劑作為助劑，使試管中的助劑添加量分別為0.10%和0.20%，同時設置不加助劑的對照，并向對照加入相同體積的無菌水，每個處理設置3個平行。30 d 后取樣，通過稀釋涂布平板法計算有效活菌數。

2.4 液體菌劑對土壤中農藥殘留的降解效果

按照“2.2.2”節中保護劑的配比分別將保護劑加入到djl-6、D-2的液體菌劑中保存45 d后，取 10 mL 菌劑各自加入到干土中含量為5 mg/kg多菌靈及啶蟲脒干土的塑料杯中，10 d后測定土壤中農藥的殘留量，并計算降解率。如圖3、圖4所示，djl-6 液體菌劑對土壤中農藥殘留降解率最高的組合為正交組合9，10 d內降解率達95.23%;其他組合的降解率與CK（不加任何保護劑）相比也有明顯提高，而在相同條件下CK降解率只能達到48.82%。D-2液體菌劑對土壤中農藥殘留降解率最高的組合為正交組合5，10 d內其降解率達到了92.75%，其他組合的降解率與CK（不加任何保護劑）相比也有明顯提高，而CK在相同條件下降解率只能達到41.21%。

3 討論與結論

微生物液體菌劑因工藝簡單、制作成本低被廣泛使用，但由于微生物極易受到周圍環境的影響，在運輸、保存、使用過程中菌劑的活性會發生變化[17-19]，如何提高菌劑的活性以及有效菌存活率成為活菌制劑亟需解決的難題。研究表明，向菌劑中添加保護劑以及抑制劑可以提高菌劑的活性，降低菌劑產品的污染率[20]。本研究發現，加入防腐劑苯甲酸鈉后，與對照組相比雜菌率大大降低。進一步研究發現，當苯甲酸鈉的添加量達到一定值后，不會出現雜菌污染，這與車建美等的研究結果[21]一致。這說明防腐劑的加入有效地抑制了雜菌的生成，使多菌靈、啶蟲脒降解菌株更好發揮功能。李劍峰等選擇了青霉素作為保護劑加入到解磷菌劑中使得目標菌的增值速度變慢，提升了菌種的活力[22]。本研究通過正交試驗研究出了保護劑的最佳組合，加入保護劑后，多菌靈、啶蟲脒降解菌株的活菌數增加，液體菌劑保存30 d仍具有明顯的降解效果，這表明保護劑的加入延長了菌劑的使用期。本研究均在盆缽中進行，下一步農藥殘留污染土壤的修復工作將在田間進行，實時監測菌株djl-6和菌株D-2在試驗田中定殖的生物量和對農藥的降解。

本研究表明，通過添加苯甲酸鈉、丙酸鈣、山梨酸鉀3種具有抑菌防霉作用的防腐劑，分別對菌株djl-6和菌株D-2的雜菌率進行計算，發現2株降解菌均以苯甲酸鈉作為防腐劑效果最好。通過液體菌劑保護劑的正交篩選，降解菌djl-6復配保護劑的最佳添加量為0.10%的檸檬酸鈉、0.30%的羧甲基纖維素、0.20%的CaCl2。降解菌D-2復配保護劑的最佳添加量為0.10%的糊精、0.20%的檸檬酸鈉、0.30%的CaCl2。通過正交試驗篩選的菌劑助劑能夠有效提高細菌存活率，其中djl-6的發酵液中活菌數能夠提高32.03%，D-2的發酵液中的活菌數能提高38.70%。添加有保護劑保存30 d的菌株djl-6的液體菌劑在3 d內最多能夠降解93.65%的50 mg/L多菌靈，添加有保護劑保存30 d的菌株D-2的液體菌劑在3 d內最多能夠降解85.32%的50 mg/L啶蟲脒。添加有保護劑的保存45 d的菌株djl-6的液體菌劑，在10 d內能將干土中含量為5 mg/kg的多菌靈降解95.23%。添加有保護劑的保存45 d的菌株D-2的液體菌劑，在 10 d 內能將干土中含量為5 mg/kg的啶蟲脒降解92.75%。本研究為農藥降解菌菌劑的生產應用及保存提供理論基礎。

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