微生物降解昭通褐煤提高游離腐殖酸含量

程娟 何環 衡曦彤 趙陽 劉健 石開儀 曹清河 李成果

摘要：篩選到1株對云南省昭通褐煤降解效果較好的菌株H3，經分子生物學鑒定，該菌株與青霉菌Penicillium griseopurpureum的相似度為96%。通過正交試驗篩選H3菌株生物降解昭通褐煤產游離腐殖酸的主要影響因素，結果表明，煤樣粒度會明顯影響H3菌株對煤的生物降解，并且當粒度小于0.074 mm、反應溫度為30 ℃、反應時間為7 d時，菌株H3對褐煤的降解效果最好，經降解后褐煤中游離腐殖酸含量為70.34%，提高35.87%，降解率達到56.25%。通過工業分析、X射線衍射儀（XRD）、傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）分析了微生物降解前后褐煤性質的變化，結果表明經H3菌株降解后昭通褐煤的水分和固定碳含量略有上升，而揮發分和灰分含量略有下降，煤中一部分芳香環可能被真菌破壞，使其微晶結構發生變化。同時，經過微生物降解后的褐煤，部分碳碳雙鍵和碳氮單鍵消失，說明原煤部分官能團被破壞。

關鍵詞：褐煤;生物降解;游離腐殖酸;青霉菌;降解工藝優化

中圖分類號： TQ536;S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0296-06

我國煤炭資源較豐富，其中低階煤含量占煤炭總儲備量的50%，低階煤包含褐煤、長焰煤、弱黏煤、不黏煤、氣煤、焦煤等[1]。目前，直接燃燒利用低階煤存在嚴重的能效和環境問題，因此實現低階煤的清潔高效利用意義重大。低階煤是一種富含腐殖酸的資源，其中腐殖酸的含量為10%～80%，從中提取的腐殖酸具有較高的生化活性，屬于高附加值產品，目前已在農業、工業、醫藥衛生、環境保護、炭材料制備等領域中廣泛應用[2-3]。提取低階煤腐殖酸所用的傳統化學方法污染大、成本高。

生物技術方法是一種環境友好型辦法，近年來利用微生物降解煤獲取腐殖酸的方法應用也越來越廣泛[3]。Can等利用RBK 7細菌菌株對哈薩克斯坦褐煤進行降解，從中提取了腐殖酸并應用于香菜種植，發現提取的腐殖酸對土壤肥力和發芽率有改善作用[4]。Yang等采用Penicillium decumbens P6純化酯酶降解褐煤，結果表明酯酶對褐煤有解聚作用，可產生腐殖酸[5]。Miszkiewicz等利用尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）1101菌株降解氧化劑預處理的褐煤，結果顯示尖孢鐮刀菌1101菌株能夠提高褐煤的液化程度和游離腐殖酸含量[6]。

煤種、菌種的選擇及匹配情況是影響微生物降解煤效果的重要因素;除此之外，在煤和菌種確定的情況下，微生物降解煤的主要影響因素有煤粒度、菌接種量、溶煤時間、溶煤溫度、環境溫度等[7-8]。Kang等采用4種細菌對神木褐煤進行了生物降解試驗，通過單因素試驗、正交試驗，得到最佳條件下煤的生物降解率可達53.6%[9]。Sabar等從巴基斯坦低階煤樣品中分離得到1株真菌（AD-1菌株），對AD-1菌株介導的煤降解反應進行優化，表明AD-1菌株在1.5%葡萄糖和0.5%加煤率的條件下培養11 d可以釋放出煤樣中大量的有機物[10]。尹艷通過正交試驗優化了多黏類芽孢桿菌降解褐煤的工藝條件，得到煤樣粒度、菌液用量、降解時間、煤漿濃度等各因素的最優水平[11]。

腐殖酸按照存在形態可分為游離腐殖酸和（鈣、鎂）結合腐殖酸[12]。結合態腐殖酸生物活性較低，在農業等領域中無法直接應用，只有游離腐殖酸才具有固氮、解磷、釋鉀的良好作用[13]，因此提高煤質腐殖酸中水溶性游離腐殖酸含量有著重要意義。云南省昭通市褐煤儲存量很豐富，其中所含的煤質腐殖酸資源有待利用。本研究從云南省昭通市褐煤煤田周邊土壤中分離菌種，篩選出對褐煤有較好液化效果的真菌進行分子生物學鑒定，然后通過正交試驗優化影響生物降解試驗的因素，并對褐煤降解前后進行物化性質分析，以期為該地區褐煤資源的利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 真菌的篩選鑒定

本試驗采用的褐煤樣品來源于云南省昭通市的露天褐煤，其中總腐殖酸、游離腐殖酸含量分別為37.55%、34.47%。從取回昭通褐煤樣品中分離真菌，將分離得到的真菌利用孟加拉紅瓊脂培養基[14]培養，菌種長滿平板后，在菌體表面均勻地撒上0.3 g褐煤樣品，將平板倒置，于28 ℃培養箱中培養，每隔24 h觀察1次微生物對煤的降解情況。采用真菌DNA抽提試劑盒（HP Fungal DNA Kit，產品編號為D3195，OMEGA公司）提取真菌DNA，進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。擴增條件：95 ℃變性 10 min;94 ℃變性30 s，57 ℃ 復性30 s，72 ℃延伸 60 s，30個循環;72 ℃延伸5 min。PCR擴增后產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]切膠純化的PCR產物送至廣州賽哲生物科技股份有限公司測序。將菌株的基因序列與美國國家生物技術信息中心（NCBI）網中GenBank序列數據庫進行比較，選取與之同源性最高的5種菌株的基因序列，采用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，比較其序列同源性。

1.2 褐煤生物降解條件優化

根據前期單因素試驗的結果采用正交試驗進一步篩選昭通褐煤降解的最優條件。選用培養48 h的菌種進行平板溶煤試驗，設置煤樣粒度（A）、反應溫度（B）、反應時間（C）等3個影響因素，每個因素分別設置3個水平，不考慮各因素的交互作用[15-16]。如表1、表2所示，正交試驗采用L9（34）正交表。測定反應前后褐煤的降解率、游離腐殖酸含量，根據GB/T 35107—2017《礦物源腐殖酸肥料中可溶性腐殖酸含量的測定》[17]測定褐煤中游離腐殖酸的含量，降解率（η）的計算方法如下：

使用直徑為15 cm的大平板，將菌種劃線培養72 h后，菌絲布滿整個平板，撒入0.8 g不同粒徑的干燥褐煤煤樣，分別放在28、30、35 ℃的恒溫培養箱中，按正交試驗設計要求反應3、5、7 d。反應結束后，用去離子水沖洗掉平板上殘留的煤樣，沖洗液于10 000 r/min條件下離心10 min，隨后收集沉淀物，于70 ℃恒溫箱中干燥至恒質量，分析褐煤的降解率和游離腐殖酸含量。

1.3 褐煤生物降解前后理化性質的分析

用去離子水將平板上生物降解后的殘煤沖洗下來，在10 000 r/min條件下離心10 min，將離心管中的沉淀物于100 ℃干燥3 h后收集樣品。將原煤和殘煤樣品研磨至粒度為75 μm，制備好煤樣送至江蘇地質礦產設計研究院進行工業分析。煤樣研磨至粒度為 48 μm，于105 ℃真空干燥2 h，采用德國布魯克公司D8 Advance型X射線衍射（XRD）儀分析原煤和降解后殘煤礦物組成;將樣品與溴化鉀粉按質量比1 ∶ 120的比例混合，研磨成片劑樣品，采用德國布魯克公司VERTEX 80 V型傅立葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對原煤和殘煤樣品進行分析，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描32次[18]。

2 結果與分析

2.1 真菌的篩選鑒定

從昭通褐煤中分離出H3菌株，將倒置平板于30 ℃恒溫培養箱培養72 h后加煤培養，觀察結果如圖1所示。H3菌株菌落呈乳白色，菌絲不斷擴大直到覆蓋整個培養皿，生長后期變成暗綠色。待菌落長滿培養皿，均勻撒入0.3 g褐煤煤樣（煤樣過200目篩，于70 ℃烘箱中干燥3 h預處理），72 h后觀察褐煤降解情況，可以看到菌株生長狀況良好，其中H3菌株平板上出現了明顯的液滴（如圖1-b中箭頭所示），說明該菌株對昭通褐煤具有降解效果。

對H3菌株進行分子生物學鑒定，利用PCR擴增ITS區域，測序后與GenBank中的已知序列進行對比，結果如圖2所示，H3菌株與Penicillium griseopurpureum的部分序列相似率為96%，期望值為0，與原物種序列相似度為99%，由此可以確定H3菌株為青霉屬真菌。

2.2 正交試驗

由表3、表4分析可知，試驗結果的影響因素表現為A>C>B，即煤樣粒度對該試驗影響最大，其次為反應時間，反應溫度影響最小。在試驗條件下A、B、C 3個因素的最優水平組合為A3B2C3，即煤樣粒度小于0.074 mm、反應溫度為 30 ℃、反應天數為7 d，在該條件下經降解后褐煤中游離腐殖酸含量為70.34%，相較原煤（據“1.2”節測得原煤中游離腐殖酸的含量為34.47%）提高35.87%，降解率達到56.25%。

煤樣粒度為0.150～0.500 mm、0.074～0.150 mm 時，反應產生的游離腐殖酸含量基本相同，在煤樣粒度小于0.074 mm時，游離腐殖酸含量大幅增加;煤樣粒度越小，煤樣與菌絲體接觸的面積就越大，更容易與煤反應，加速降解作用，產生腐殖酸[19]。由觀察結果可知，游離腐殖酸含量隨著溫度上升而下降，筆者推測28 ℃可能是H3菌株的最佳生長溫度，因此在28 ℃時降解效果最佳，隨著溫度升高降解效果減弱。降解時間達到7 d，游離腐殖酸含量相比之前最高，表明隨著降解時間增長，游離腐殖酸含量不斷提高，提高幅度逐漸減少，可能隨著時間的延長培養基內營養物質不足，從而無法滿足菌體降解煤的需要[20]。

2.3 生物降解前后煤的物化性質

對褐煤原煤以及最佳試驗條件處理后的殘煤進行工業分析，如表5所示，反應后褐煤的灰分和揮發分含量都有所降低，固定碳含量增加，說明微生物會降解煤產生一部分腐殖酸碳，從而使固定碳含量增加。

如圖3所示，反應前后峰的位置沒有變化，說明其礦物組成無明顯變化，但是反應后的峰強度變化較大，據Jiang等的研究[21]可初步判定褐煤經過降解后，結晶度變高。從表6可以看出，反應前后褐煤的片層間距從0.171 8 nm增加至0.172 3 nm，增加的數值很小，基本不變;反應前后的層片堆砌厚度（Lc）從原來的 1.087 6 nm 上升至1.116 9 nm，層片原來的2.129 nm轉變為2.186 nm，La隨煤化程度的增加而增大。綜上所述，褐煤降解前后煤的微晶結構的變化可能是微生物降解過程中降解平均堆砌厚度增高，Lc為1.2 nm時，芳香層片的堆砌層數為3～4層，反應前后的層片直徑（La）由了一部分芳香環，使其微晶結構發生變化[22-23]。

如圖4、表7所示，結合Choudhury等的研究[24-25]對比反應前后褐煤的FT-IR分析結果可知，褐煤降解前后出峰的位置基本未發生變化。其中，原煤中碳碳雙鍵吸收峰消失，可能是在微生物轉化過程中雙鍵斷裂，結合氧生成了C—O等含氧官能團;原煤仲酰胺的C—N吸收峰消失，也說明降解后的褐煤部分官能團被破壞[26-28]，證明H3菌株對褐煤有一定的降解作用。

3 結論

本研究分離鑒定了1株對云南昭通褐煤有降解效果的菌株H3，采用正交試驗對H3菌株降解褐煤的工藝參數進行了優化并對降解前后煤的物化性質進行了分析，得到結論如下：

（1）菌株H3在固體平板上菌落呈乳白色，生長后期菌絲變綠，系統發育分析結果表明該菌株與Penicillium griseopurpureum序列相似率為96%，因此將其命名為Penicillium griseopurpureum H3，固體平板溶煤試驗結果表明該菌株對褐煤具有較好的降解效果。

（2）正交試驗結果表明菌株降解褐煤產生游離腐殖酸的最佳條件為煤樣粒度小于0.074 mm、反應溫度為30 ℃、反應時間為7 d，在該條件下褐煤中游離腐殖酸含量為70.34%，提高35.87%，降解率達到56.25%。

（3）經菌株H3降解后褐煤的灰分和揮發分含量都降低，固定碳含量增加，在降解過程中產生了一部分芳香環，使得其微晶結構發生變化。同時，經過微生物轉化后的褐煤，碳碳雙鍵和碳氮單鍵消失，證明原煤部分官能團被破壞。

參考文獻：

[1]張莉萍，黑大偉. 低階煤提質技術現狀及完善途徑[J]. 化工管理，2017，24：137.

[2]張傳祥，張效銘，程 敢. 褐煤腐殖酸提取技術及應用研究進展[J]. 潔凈煤技術，2018，24（1）：6-12.

[3]Valero N O，GómezI L C，Guerra M P，et al. Production of humic substances through coal-solubilizing bacteria[J]. Brazilian Journal of Microbiology，2014，45（3）：911-918.

[4]Can Y，Qiao X，Akimbekov N S，et al. The solubilization of lignite by selective strains of bacteria[J]. Eurasian Journal of Ecology，2019，59（2）：51-59.

[5]Yang Y，Yang J S，Li B Z，et al. An esterase from Penicillium decumbens P6 involved in lignite depolymerization[J]. Fuel，2018，214：416-422.

[6]Miszkiewicz H，Bielecki S，Kadubowski S. Biosolubilization of polish chemically oxidated brown coal[J]. Engineering and Protection of Environment，2016，19（1）：97-108.

[7]Bao Y，Huang H P，He D S. Microbial enhancing coal-bed methane generation potential，constraints and mechanism-a mini-review[J]. Journal of Natural Gas Science and Engineering，2016，35：68-78.

[8]Mishra S，Akcil A，Panda S，et al. Effect of span-80 and ultrasonication on biodesulphurization of lignite by Rhodococcus erythropolis：lab to semi-pilot scale tests[J]. Minerals Engineering，2018，119：183-190.

[9]Kang H L，Liu X R，Zhang Y W，et al. Bacteria solubilization of shenmu lignite：influence of surfactants and characterization of the biosolubilization products[J]. Energy Sources，Part A：Recovery，Utilization，and Environmental Effects，2019：1-19.

[10]Sabar M A，Ali M I，Fatima N，et al. Degradation of low rank coal by Rhizopus oryzae isolated from a Pakistani coal mine and its enhanced releases of organic substances[J]. Fuel，2019，253：257-265.

[11]尹 艷. 平莊褐煤的微生物降解轉化研究[D]. 淮南：安徽理工大學，2013.

[12]鐘世霞，徐玉新，駱洪義，等. 超聲波活化風化煤腐殖酸的影響研究[J]. 山東農業大學學報（自然科學版），2014，45（1）：6-9.

[13]王洪富，高進華，李昆侖，等. 腐殖酸活化原料指標評價研究[J]. 磷肥與復肥，2019，34（6）：28-30.

[14]黃 瑩，紀仁飛，陳艷紅，等. 一株紅樹內生真菌的形態學及28S rDNA序列鑒定[J]. 激光生物學報，2017，26（1）：73-77.

[15]李非楊. 風化煤的微生物液化工藝研究[D]. 鄭州：鄭州大學，2018.

[16]馮曉霄. 新疆低價煤微生物液化研究[D]. 烏魯木齊：新疆大學，2014.

[17]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. GB/T 35107—2017礦物源腐殖酸肥料中可溶性腐殖酸含量的測定[S]. 北京：中國標準出版社，2018.

[18]Wang S Q，Tang Y G，Schobert H H，et al. FTIR and 13C NMR investigation of coal component of late permian coals from southern China[J]. Energy Fuels，2011，25（12）：5672-5677.

[19]石開儀，何 環，李 志. 白腐真菌S.commne對昭通褐煤生物液化研究[J]. 煤炭技術，2016，35（9）：276-278.

[20]Haider R，Ghauri M A，Akhtar k. Isolation of coal degrading fungus from drilled core coal sample and effect of prior fungal pretreatment on chemical attributes of extracted humic acid[J]. Geomicrobiology Journal，2015，32（10）：944-953.

[21]Jiang J Y，Yang W H，Cheng Y P，et al. Molecular structure characterization of middle-high rank coal via XRD，Raman and FTIR spectroscopy：implications for coalifcation[J]. Fuel，2019，239：559-572.

[22]Ahmeda M A，Blesa M J，Juan R，et al. Characterisation of an Egyptian coal by Mossbauer and FT-IR spectroscopy[J]. Fuel，2003，82（14）：1825-1829.

[23]Baysal M，Yürüm A，Yildiz B，et al. Structure of some western Anatolia coals investigated by FTIR，Raman， 13C solid state NMR，spectroscopy and X-ray diffraction[J]. International Journal of Coal Geology，2016，163：166-176.

[24]Choudhury R，Gupta U N，Waanders F B，et al. A multi-analytical study on the sulphur components in some high sulphur Indian Tertiary coals[J]. Arabian Journal of Geosciences，2016，9：100.

[25]Qin Z H，Chen H，Yan Y J，et al. FTIR quantitative analysis upon solubility of carbon disulfide/N-methyl-2-pyrrolidinone mixed solvent to coal petrographic constituents[J]. Fuel Processing Technology，2015，133：14-19.

[26]He X Q，Liu X F，Nie B S，et al. FTIR and Raman spectroscopy characterization of functional groups in various rank coals[J]. Fuel，2017，206：555-563.

[27]Cepus V，Borth M，Seit M. IR spectroscopic characterization of lignite as a tool to predict the product range of catalytic decomposition[J]. International Journal of Clean Coal and Energy，2016，5：13-22.

[28]Cui X，Li X L，Li Y M，et al. Evolution mechanism of oxygen functional groups during pyrolysis of Datong coal[J]. Journal of Thermal Analysis Calorimetry，2017，129（2）：1169-1180.