漢氏菱形藻生理特性對(duì)硝基苯脅迫的響應(yīng)

杜慶才 石先陽(yáng) 胡春香

摘要：研究不同質(zhì)量濃度硝基苯（nitrobeneze）對(duì)漢氏菱形藻（Nitzschia hantzschia）生長(zhǎng)、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素a含量和藻細(xì)胞導(dǎo)電率的影響。結(jié)果表明，隨著硝基苯質(zhì)量濃度的升高，漢氏菱形藻的生長(zhǎng)受到抑制，處理5 d時(shí)藻培養(yǎng)液依次由深黃色逐漸變?yōu)闇\黃色;2 d后可溶性糖含量升高，1 d時(shí)100 mg/L硝基苯處理組可溶性蛋白含量為對(duì)照組的89.1%，為最低值，之后呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。低質(zhì)量濃度硝基苯對(duì)藻細(xì)胞葉綠素a含量有促進(jìn)作用，中、高質(zhì)量濃度有抑制作用，而50 mg/L處理3 d后葉綠素a含量逐漸恢復(fù);藻細(xì)胞的電導(dǎo)率隨硝基苯質(zhì)量濃度的升高而逐漸升高，低質(zhì)量濃度處理3 d后電導(dǎo)率逐漸恢復(fù)，而高質(zhì)量濃度傷害藻細(xì)胞，導(dǎo)致漢氏菱形藻逐漸死亡。

關(guān)鍵詞：硝基苯;漢氏菱形藻;生理;電導(dǎo)率;環(huán)境脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)： X172 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0302-05

硝基苯類(lèi)是被廣泛應(yīng)用的化工原料，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年大約有因硝基苯類(lèi)產(chǎn)生的3萬(wàn)t以上污染物流入環(huán)境中[1]，但隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展該類(lèi)化合物的需求呈明顯上升趨勢(shì)。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（EPA）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)化學(xué)品廠的廢水中硝基苯含量最高可達(dá)190 mg/L，調(diào)查案例中有3%以上的工廠廢水中的硝基苯含量在100 mg/L以上[2]。2005年，國(guó)內(nèi)突發(fā)龍騰化工廠硝基苯車(chē)間爆炸、海門(mén)港化工廠硝基苯裝置爆炸、中石油吉林石化公司雙苯廠爆炸等事故導(dǎo)致硝基苯直接泄露[3-4]。硝基苯是高毒性物質(zhì)，可通過(guò)接觸或食物鏈富集危害生物[5-6]。國(guó)內(nèi)外對(duì)硝基苯類(lèi)化合物的研究主要集中于它們?cè)谏矬w內(nèi)的富集與毒性毒理機(jī)制方面[7-11]。藻類(lèi)是水生態(tài)系統(tǒng)的重要初級(jí)生產(chǎn)者，漢氏菱形藻（Nitzschia hantzschia）是淡水生態(tài)系統(tǒng)中的廣適物種，硝基苯對(duì)其生理特性的脅迫響應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道。本研究針對(duì)硝基苯污染對(duì)水生態(tài)環(huán)境中漢氏菱形藻的生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，探究硝基苯對(duì)其的生理響應(yīng)機(jī)制，旨在為探索污染物硝基苯對(duì)環(huán)境影響情況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

漢氏菱形藻由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻類(lèi)藻種庫(kù)提供。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的漢氏菱形藻接種于250 mL三角瓶中，加 100 mL HB-D1培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃，連續(xù)24 h光照培養(yǎng)，光照度約2 000 lx[40 μmol/（m2·s）]，置培養(yǎng)箱中定時(shí)搖動(dòng)：5次/d。無(wú)菌臺(tái)依次加10、50、100 mg/L硝基苯，各處理組設(shè)3個(gè)平行樣，分別在0、24、48、72、96、120 h時(shí)取樣測(cè)定各生理指標(biāo)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.2.1 硝基苯處理對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 從轉(zhuǎn)接藻種開(kāi)始用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，每隔24 h測(cè)定經(jīng)硝基苯處理的藻液的吸光度，連續(xù)測(cè)定5 d，取3個(gè)平行樣的平均值。

1.2.2 可溶性蛋白含量的測(cè)定 取5 mL樣品離心后，加去離子水2 mL超聲波破碎，4 ℃離心上清液待測(cè)。可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán) G-250 法并參照Bradford等的方法[12-13]。

1.2.3 可溶性糖含量的測(cè)定 可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法。

1.2.4 葉綠素a含量的測(cè)定 取一定藻液4 ℃離心后，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，避光4 ℃下提取24 h，4 ℃離心、轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，上清液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。根據(jù)公式Ca=13.95D665 nm-6.88D649 nm;計(jì)算葉綠素的含量[14]。

1.2.5 藻細(xì)胞電導(dǎo)率的測(cè)定 取藻液8 mL室溫下5 000 r/min用去離子水洗滌3次，加入16 mL去離子水，室溫避光放置24 h，在20～25 ℃恒溫下，用電導(dǎo)儀測(cè)定溶液的電導(dǎo)率。測(cè)過(guò)電導(dǎo)率后，再放入100 ℃沸水浴中15 min，冷卻后再在20～25 ℃室溫下測(cè)定其煮沸電導(dǎo)率，傷害率=處理電導(dǎo)率/煮沸電導(dǎo)率×100%[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝基苯對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同的硝基苯質(zhì)量濃度脅迫漢氏菱形藻的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。低質(zhì)量濃度 10 mg/L 硝基苯處理，對(duì)漢氏菱形藻生長(zhǎng)抑制作用不明顯;50 mg/L處理在2 d內(nèi)表現(xiàn)輕度的抑制生長(zhǎng)，2 d后開(kāi)始逐漸恢復(fù)生長(zhǎng);而100 mg/L硝基苯脅迫對(duì)漢氏菱形藻生長(zhǎng)抑制顯著。5 d 后藻液由深黃色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色后接近透明現(xiàn)象，具體情況見(jiàn)圖2。與對(duì)照相比藻液顏色變化效果很明顯，硝基苯對(duì)漢氏菱形藻生長(zhǎng)的影響呈現(xiàn)較為明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，與萊茵衣藻影響結(jié)果一致[15]，不同的是50 mg/L硝基苯脅迫下，漢氏菱形藻2 d后逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)，而萊茵衣藻需要4 d后才能逐步恢復(fù)生長(zhǎng)，在相同脅迫條件下漢氏菱形藻表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。

2.2 硝基苯對(duì)可溶性糖含量的影響

由圖3可知，硝基苯處理使得漢氏菱形藻的可溶糖含量在2 d下降到最低點(diǎn)，之后藻細(xì)胞內(nèi)可溶性糖含量隨硝基苯質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)梯度升高現(xiàn)象。可能是漢氏菱形藻的自身物質(zhì)被降解成可溶性糖從而緩解了對(duì)藻細(xì)胞的傷害。在試驗(yàn)處理組內(nèi)，藻細(xì)胞可溶性糖含量增加越迅速硝基苯質(zhì)量濃度越高，5 d時(shí)，50、100 mg/L質(zhì)量濃度處理組高于對(duì)照，10 mg/L質(zhì)量濃度處理組低于對(duì)照。可能是50、100 mg/L質(zhì)量濃度硝基苯脅迫下，藻細(xì)胞為應(yīng)對(duì)不利環(huán)境分解自身物質(zhì)應(yīng)對(duì)，而10 mg/L質(zhì)量濃度脅迫下，藻細(xì)胞質(zhì)量濃度弱于對(duì)照且受傷害程度較弱，因此藻細(xì)胞分解自身糖類(lèi)物質(zhì)較少。

2.3 硝基苯對(duì)可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，在1 d時(shí)，10、50、100 mg/L的硝基苯處理組均呈現(xiàn)最低的可溶性蛋白含量，依次是對(duì)照含量的63.7%、71.7%、93.6%，而且在1～3 d呈現(xiàn)出明顯的回升趨勢(shì)。3 d后10 mg/L硝基苯處理與對(duì)照相比無(wú)明顯差異。10、50 mg/L質(zhì)量濃度處理組與對(duì)照在4 d后，樣品可溶性蛋白含量處于穩(wěn)定狀態(tài)，100 mg/L質(zhì)量濃度處理有上升趨勢(shì)，說(shuō)明藻細(xì)胞逐漸適應(yīng)環(huán)境脅迫。

2.4 硝基苯對(duì)葉綠素a含量的影響

由圖5可知，質(zhì)量濃度為10 mg/L硝基苯處理對(duì)漢氏菱形藻葉綠素a含量有促進(jìn)作用;50 mg/L硝基苯在處理2 d之前有抑制作用，處理3 d后藻細(xì)胞葉綠素a含量有增加趨勢(shì);而100 mg/L硝基苯對(duì)漢氏菱形藻葉綠素a含量抑制作用比較明顯且沒(méi)有恢復(fù)的跡象，與漢氏菱形藻呈現(xiàn)淺黃色生長(zhǎng)現(xiàn)象相吻合。

2.5 硝基苯對(duì)藻細(xì)胞的電導(dǎo)率情況

在正常情況下，生物細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)具有選擇性透過(guò)能力，當(dāng)處于硝基苯脅迫條件下，漢氏菱形藻的藻細(xì)胞膜受到破壞，膜通透性變大，導(dǎo)致胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)外滲，所以直接表現(xiàn)在細(xì)胞浸提液的導(dǎo)電率增強(qiáng)，細(xì)胞浸提液導(dǎo)電率增大與膜通透性增大密切相關(guān)，而膜通透性程度增加與環(huán)境脅迫強(qiáng)度有直接關(guān)系。由圖6可知，漢氏菱形藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，各處

理組與對(duì)照相比，隨硝基苯的質(zhì)量濃度增大，對(duì)藻類(lèi)的傷害率呈現(xiàn)梯度上升。10 mg/L硝基苯處理，3 d 時(shí)藻細(xì)胞基本恢復(fù)正常狀態(tài);50 mg/L硝基苯處理3 d后逐漸恢復(fù)，到處理后5 d時(shí)基本上恢復(fù)到正常狀態(tài);而100 mg/L硝基苯處理，對(duì)漢氏菱形藻藻細(xì)胞的傷害是不能恢復(fù)的，與前面的生長(zhǎng)影響情況測(cè)定得出的情況一致。

3 討論

漢氏菱形藻生理特性對(duì)硝基苯脅迫的響應(yīng)與脅迫質(zhì)量濃度密切相關(guān)。10 mg/L硝基苯對(duì)漢氏菱形藻的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，而100 mg/L硝基苯則對(duì)漢氏菱形藻生理生長(zhǎng)有明顯的抑制效應(yīng)，直至導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。雖然自然界水體環(huán)境中的硝基苯濃度通常較低，但藻細(xì)胞暴露于100 mg/L硝基苯質(zhì)量濃度下還是完全有可能的[16-17]。因?yàn)橄趸奖粡V泛應(yīng)用，世界各地主要河流水系中普遍存在污染物硝基苯[18-21]，而當(dāng)硝基苯污染事件爆發(fā)時(shí)，在小環(huán)境內(nèi)，硝基苯的污染往往高出100 mg/L，藻類(lèi)可能遭受更高濃度的硝基苯脅迫，從而被抑制生長(zhǎng)，進(jìn)一步影響淡水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

本研究顯示，10 mg/L硝基苯脅迫下對(duì)漢氏菱形藻吸光度幾乎沒(méi)有抑制作用，而100 mg/L硝基苯質(zhì)量濃度下6 d后顯微鏡很難檢測(cè)到有活的藻細(xì)胞，與對(duì)萊茵衣藻的研究結(jié)果相似。通過(guò)50 mg/L質(zhì)量濃度硝基苯處理發(fā)現(xiàn)，處于脅迫環(huán)境下漢氏菱形藻藻細(xì)胞通過(guò)自身釋放可溶性糖、可溶性蛋白等有機(jī)物的應(yīng)激反應(yīng)適應(yīng)環(huán)境。漢氏菱形藻的可溶性糖含量下降表明，高質(zhì)量濃度硝基苯脅迫下能夠影響藻類(lèi)的能量代謝與利用，并且高質(zhì)量濃度脅迫下可能導(dǎo)致漢氏菱形藻藻細(xì)胞葉綠素a含量降低進(jìn)而影響光合作用的性能[15]。

硝基苯對(duì)漢氏菱形藻的脅迫研究發(fā)現(xiàn)，在處理48 h內(nèi)可能由于環(huán)境脅迫的原因，藻細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用較低，表現(xiàn)出漢氏菱形藻藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接培養(yǎng)48 h內(nèi)自身的可溶性糖含量一直在減少。在 48 h 時(shí)處理組與對(duì)照組相比，漢氏菱形藻可溶性糖含量分別是對(duì)照組的81.82%、67.93%、62.64%。而再持續(xù)培養(yǎng)48 h后，尤其在3 d后藻細(xì)胞的可溶性糖含量回升最快，說(shuō)明漢氏菱形藻對(duì)100 mg/L硝基苯含量以下脅迫條件下，48 h是其逐步恢復(fù)生理生長(zhǎng)的臨界點(diǎn)。4 d后可溶性糖含量回升到 170 mg/L 左右并逐漸趨于穩(wěn)定，表明藻細(xì)胞適應(yīng)后能利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并有效地進(jìn)行物質(zhì)如糖類(lèi)的合成。可能是藻細(xì)胞生長(zhǎng)后期細(xì)胞吸收培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力下降，另一因素可能是培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐步利用減少而受限制。漢氏菱形藻和萊茵衣藻在硝基苯脅迫的逆境條件下[15]，漢氏菱形藻表現(xiàn)出較強(qiáng)較快的適應(yīng)能力，100 mg/L硝基苯脅迫條件下，萊茵衣藻逐步快速死亡，6 d時(shí)幾乎檢測(cè)不到存活的藻細(xì)胞，而漢氏菱形藻通過(guò)分解自身細(xì)胞質(zhì)如可溶性糖、可溶性蛋白被動(dòng)適應(yīng)逆境脅迫，2 d后可以逐步恢復(fù)生理生長(zhǎng)。研究還表明，24 h內(nèi)低、中、高質(zhì)量濃度硝基苯脅迫下漢氏菱形藻細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)含量與對(duì)照相比明顯下降，而3 d后各質(zhì)量濃度處理組基本上恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)。可溶性蛋白與可溶性糖均是藻細(xì)胞內(nèi)主要的細(xì)胞質(zhì)，在硝基苯脅迫下，漢氏菱形藻通過(guò)自身物質(zhì)分泌出可溶性蛋白到細(xì)胞外起到很好緩沖與保護(hù)作用，如果脅迫環(huán)境進(jìn)一步增強(qiáng)，由于藻細(xì)胞分泌蛋白達(dá)到極限會(huì)直接影響藻細(xì)胞的生理功能，就會(huì)使?jié)h氏菱形藻生長(zhǎng)受阻直至因細(xì)胞破損死亡。漢氏菱形藻光合作用場(chǎng)所在葉綠體上，光合色素是物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，漢氏菱形藻對(duì)不同質(zhì)量濃度硝基苯脅迫，光合色素中葉綠素a含量有不同的響應(yīng)。較高質(zhì)量濃度硝基苯脅迫下光合色素含量明顯降低，可能是細(xì)胞膜系統(tǒng)功能在硝基苯脅迫下遭到破壞，有研究表明25 mg/L硝基苯可以傷害植物膜系統(tǒng)[9]，也可能是硝基苯上的硝基官能團(tuán)與葉綠體捕光復(fù)合體系中的蛋白質(zhì)結(jié)合[22]，導(dǎo)致漢氏菱形藻的葉綠體中捕光復(fù)合體受抑制，使其葉綠素a含量降低，光合作用能力下降，從而影響漢氏菱形藻光合色素含量，與纖細(xì)裸藻、萊茵衣藻影響有相似性[23]。藻細(xì)胞光合色素含量與藻細(xì)胞生長(zhǎng)中的吸光度也呈現(xiàn)較好的一致性。本研究表明，硝基苯對(duì)藻類(lèi)的毒性可能主要是先通過(guò)分解自身的可溶性糖類(lèi)、蛋白質(zhì)減輕毒害，當(dāng)硝基苯質(zhì)量濃度較高時(shí)，藻類(lèi)自身通過(guò)分解較多自身物質(zhì)以及部分細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)變性，從而失去繼續(xù)生長(zhǎng)的可能。

高質(zhì)量濃度的硝基苯使?jié)h氏菱形藻細(xì)胞膜受到的損傷加劇，其選擇透過(guò)性增大導(dǎo)致細(xì)胞的電解質(zhì)外泄加劇，致使其傷害率上升，以至于在測(cè)試時(shí)間內(nèi)細(xì)胞沒(méi)有恢復(fù)正常的生理跡象。

4 結(jié)論

（1）漢氏菱形藻暴露在質(zhì)量濃度為100 mg/L硝基苯環(huán)境下1～6 d內(nèi)，對(duì)藻細(xì)胞的傷害是很難恢復(fù)的，即導(dǎo)致細(xì)胞死亡。（2）硝基苯質(zhì)量濃度為10、50 mg/L時(shí)，處理后1 d漢氏菱形藻的可溶性蛋白含量降至最低點(diǎn)，2 d時(shí)的可溶性糖含量降到最低點(diǎn)，之后恢復(fù)到穩(wěn)定值，這種變化趨勢(shì)反映了漢氏菱形藻對(duì)硝基苯脅迫下的響應(yīng)機(jī)制。（3）通過(guò)對(duì)硝基苯脅迫下漢氏菱形藻細(xì)胞生長(zhǎng)、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素a含量、電導(dǎo)率等生理生化響應(yīng)模式研究，結(jié)果表明10、50 mg/L硝基苯脅迫下影響漢氏菱形藻細(xì)胞的正常生理態(tài)勢(shì)，經(jīng)響應(yīng)后可以逐步恢復(fù)到正常生理生長(zhǎng)狀態(tài)，而100 mg/L硝基苯脅迫下，對(duì)藻細(xì)胞的傷害是難以恢復(fù)的。

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