p16ink4 及ki67 在宮頸脫落細胞中的表達水平與HPV16/18 感染的相關性分析

徐秀梅 米賢軍 鐘守軍 黃永霞 黃兆

( 中山市博愛醫院病理科 廣東 中山 528400)

從病毒學上來看，HPV 為人乳頭瘤病毒，是一種通過感染人的皮膚及粘膜環狀DNA 分子病毒[1]，而不同類別基因型的HPV病毒感染人體的不同部位后也會出現不同的反應與結果，目前研究確定的HPV 基因中有42 型可以感染人體并引發相關疾病，其中高危型的如16、18 型可以導致人體宮頸內上皮內瘤變甚至宮頸癌的發生[2]，較為低危的HPV 病毒則會導致人體尖銳濕疣的發生等，HPV 病毒主要是通過侵入人體細胞，使正常的基因功能失控，高危型的HPV 病毒會導致宮頸細胞的惡性增值而最終引起宮頸癌前病變，并有進一步發展為宮頸癌的可能。宮頸癌雖然作為一種惡性腫瘤，但其特點在于存在較長的從癌前病變發展為宮頸癌的過程，且針對癌前病變的早期治療可以顯著提高患者的5 年生存率，因而早期識別并檢出宮頸癌前病變就變得十分重要[3-5]。

宮頸癌是目前女性惡性腫瘤發病率第二的最常見腫瘤之一，其發病率僅次于乳腺癌，且還有上升趨勢，因而宮頸癌越來越受到世界的關注，如何早期識別診斷出乳腺癌，早期采取措施早期治療，也是人們普遍關注的問題，我國宮頸癌的發病率就已經占到了世界的1/3，實在可以稱得上是宮頸癌大國[6]。根據現有的流行病學數據來看，超過90%的宮頸癌與人乳頭瘤病毒HPV 感染相關，因其E6、E7蛋白可以與抑癌基因P53的產物蛋白相結合，從而引起p53 基因的失控性表達，進一步促進細胞周期相關蛋白質p16ink4、ki67 的表達。現有研究表示p16ink4、ki67 的表達可能先于宮頸非良性病變出現，更有一部分研究顯示p16ink4在宮頸脫落細胞中的陽性表達與HPV 具有很強的相關性，這就為p16ink4、ki67 在宮頸脫落細胞中的表達與HPV16/18 的感染相關性提供了一定的理論基礎[7-9]。

p16ink4 作為一種腫瘤抑制因子，被證實參與了多種腫瘤的發生，其可以防止細胞正常周期的失調控、無限制增殖、進一步向腫瘤轉化。而ki67 作為一種DNA 結合蛋白，表達與細胞周期中的多個階段，表達程度反映了細胞的增生狀態，因而其異常表達時可以反映腫瘤細胞的異常增殖潛能，被廣泛用于評估腫瘤細胞的增值[10]。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選2018—2019 年在我院進行宮頸脫落細胞學檢查的200 例患者標本，經10%福爾馬林固定，石蠟包埋后采用免疫組織化學的方法對其標本的鱗狀上皮、宮頸上皮內瘤變、浸潤癌等進行p16ink4、ki67 檢測，同時對標本應用多重引物的PCR 技術進行HPV16/18 表達的檢測，對兩組相關性進行探討分析，結果采用統計學方法進行處理。

1.2 方法

1.2.1 實驗前準備 進行免疫細胞化學和免疫組織化學玻璃儀器的處理，包括肥皂水煮沸、濃酸浸泡48 小時、載玻片備用等，同時準備好相應試劑。

1.2.2 免疫組織化學方法 對所有標本進行二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，經PBS 浸泡5min，3%的過氧化氫溶液室溫保存10min，再次進行微波修復，后各自滴加p16ink4（1:100）、ki67（1:50），放入4℃環境中冷藏一夜，然后經顯色、復染、酒精化、脫水、封片等步驟，等待結果。

全部患者均接受Cervista 高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢測、陰道鏡活檢，利用免疫熒光雙標檢測蛋白表達。免疫熒光雙標檢測經Thin－Prep2000 對剩余液基細胞保存液重新制片，檢測加入鼠抗人P16 和兔抗人Ki67，一抗選擇磷酸鹽緩沖液代替當成陰性對照，Cy3（紅色熒光）、FITC（黃綠色熒光）標記的抗鼠、抗兔為二抗，利用熒光顯微鏡觀察結果。

應用全自動免疫組化染色儀（深圳市森盈公司的全自動免疫組化染色系統SY7300）進行免疫組化染色，每批染色設置均設已知陽性及陰性對照。

1.3 結果判定

1.3.1 ki67 結果判定 ki67 主要在細胞核中表達，當細胞被染成棕黃色則視為陽性結果，選取高倍鏡視野下的一千個細胞計算相應著色鱗狀上皮細胞的比例，記為ki67 陽性指數。

1.3.2 p16ink4 結果判定 p16ink4 著色部位為細胞核和細胞漿，同ki67，當細胞核或者細胞漿出現著色時即視為結果陽性，再根據著色部位進行分類與評價，包括細胞核著色、細胞漿著色、細胞核和細胞漿著色。

1.4 統計學方法

使用SPSS18.0 統計學軟件對實驗結果進行統計學處理，不同病變級別的HPV 感染率用χ2檢驗進行分析，P ＜0.05 時視為差異沒有統計學意義。

2.結果

在宮頸脫落細胞中，p16ink4、ki67 在宮頸脫落細胞中的表達水平具有可以參考的臨床意義，因其表達水平的規律性表現為ki67 與p16ink4 的表達水平隨著宮頸上皮細胞損傷程度加重而表達上升，且在浸潤性癌中的陽性結果最高，超過了90%，而HPV16/18 的陽性率也隨著宮頸脫落細胞的損傷程度的加重而上升，見表1、表2。

表1 活檢組織中KI67 標記指數和p16ink4 陽性率的表達

表2 細胞學、HR-HPV 檢測用于評價宮頸高級別病變的價值（%）

3.討論

宮頸癌作為世界上女性最易發病的惡性腫瘤之一，越來越受到了世界的關注，如何早期識別及診斷出乳腺癌，早期采取措施早期治療，也是人們普遍關注的問題。我國宮頸癌的發病率就已經占到了世界的1/3，實在可以稱得上是宮頸癌大國。液基薄層細胞學檢查（TCT）和人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測是目前篩選宮頸癌較為常用的手段，但目前的水平仍存在一定的假陽性和假陰性的情況，需要尋找一種早期，高敏、高度特異性的方法來早期診斷出宮頸癌的發生，從而預防宮頸癌。

根據現有的流行病學數據來看，超過90%的宮頸癌與人乳頭瘤病毒HPV 感染相關，有研究證實，高危型的HPV 感染可以導致宮頸發生上皮內瘤變，并有極大的風險進一步發展成宮頸癌，其機制是原癌基因編發的蛋白可以通過一系列機制使得高危型的HPV-E7 基因編碼的癌基因蛋白整合到宿主細胞中去后，與Rb蛋白結合，使得pRb 失活，從而失去了對p16ink4 基因表達的抑制作用，p16ink4 的過度表達會進一步造成腫瘤細胞內的E2F 游離型增多，使得cycinD/CDK4 蛋白復合物過度表達，而cycinD/CDK4 蛋白復合物又可正反饋刺激p16ink4。

p16ink4、ki67 的表達可能先于宮頸非良性病變出現，更有一部分研究顯示p16ink4 在宮頸脫落細胞中的陽性表達與HPV 具有很強的相關性，這就為p16ink4、ki67 在宮頸脫落細胞中的表達與HPV16/18 的感染相關性提供了一定的理論基礎[11-12]。

針對2018-2019 在我院進行宮頸脫落細胞學檢查的200 例患者標本，經10%福爾馬林固定，石蠟包埋后采用免疫組織化學的方法對其標本的鱗狀上皮、宮頸上皮內瘤變、浸潤癌等進行p16ink4、ki67 檢測，同時對標本應用多重引物的PCR 技術進行HPV16/18 表達的檢測，對兩組結果相關性進行探討分析。

綜上，針對宮頸脫落細胞中ki67 及p16ink4 基因進行檢測，發現若其表達上調，則與高危型宮頸上皮內癌變具有很大的相關性，與傳統的液基薄層細胞學檢查（TCT）和人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測方法相比，可以早期懷疑宮頸癌的發生，用于臨床上早期宮頸病變的篩查[13-14]，且其假陽性率和假陰性率較之液基薄層細胞學檢查（TCT）和人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測技術均有明顯降低，具有更高的準確度，更早期的表達，取材方便患者痛苦小等優勢[15]，均可以作為臨床早期篩查宮頸癌及其癌前病變可以考慮的一項輔助檢查手段，而其標準值的確認等，尚需更嚴謹的進一步實驗探究證實。