骨髓間充質干細胞來源外泌體對大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護作用研究

田珂

（南方醫科大學南方醫院麻醉科 廣東 廣州 510515）

缺血性再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是引發急性腎損傷的主要原因，尤其是在腎臟移植的過程中，IRI情況無法避免，繼而當此情況發生時，不僅會對術后腎功能恢復造成影響，還會影響移植腎的長期存活[1-2]。因此，如何對IRI的生物學機制尋找有效保護與干預措施，在臨床一直當做重要問題進行探究。在臨床探究的結果中發現，充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）有修復與再生以及免疫調節功能，并且外源性MSC 可對急性腎損傷進行減輕[3-4]。但臨床研究資料較少，存在爭議性，加之，近幾年的臨床中發現，外泌體（exosme）可作為細胞間相互作用的重要手段，exosme 會通過膜受體或是內吞的方式進入靶細胞，并向其傳遞exosme 中所攜帶的蛋白質等細胞，產生信號復合體，激活相關分子信號通路[5-6]。因在MSC 所分泌的exosme 體積比較小，肉眼不能見到，不明確若大量提取MSC 所分泌的exosme 對IRI 所引起的急性腎損傷是否存在保護作用[7]，因而為證實這一依據，本次探究選取在我院實驗室中的SPF 級雄性SD 大鼠21 只，探究骨髓間充質干細胞來源外泌體對大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護作用，現將結果報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取SPF 級雄性SD 大鼠21 只，均飼養于我院實驗室中，時間2015 年4 月—2017 年7 月，大鼠重量范圍在200g ～250g，平均重量在（224.1±14.5）g，將實驗室大鼠進行分組、腎臟IRI 模型的建立：首先將21 只SD 雄性大鼠隨機數字分為3組，假手術組（Sham 組），缺血再灌注組（IR 組），MSC 來源exosme 處理組（IR+MSC-ex,100μgexosme/1mlPBS），每組7 只。

1.2 方法

首先建立大鼠腎臟IRI 模型：右側的輸尿管先進行結扎，在將右腎與腎蒂進行切除，繼而暴露左側腎臟，以無創血管夾夾閉左腎蒂45min，取氣管從旁側行縱行切口對皮膚、肌肉進行切開，將左側頸動脈進行游離，以24G 靜脈穿刺針行頸動脈穿刺，完成后使用套線對其固定，給予各組相應注射治療，結扎頸動脈。術后將每組大鼠分開飼養，自由飲食。

其次進行標本收集與病理學檢測：48h 各組大鼠會因頸椎脫臼而被處死，使用相關儀器對血清肌酐尿素進行查驗與檢測，并將血清與大鼠中的腎組織當作標本。用4%甲醛對各組大鼠腎臟組織進行固定，后使用石蠟包埋，常規HE 染色，在200 倍光鏡下，選取10 個腎小管在10 個視野中進行評測，觀測過程中視野要在400 倍，數量選取20 個。然后對20 個視野下的腎小管細胞凋亡數量進行記錄，并將其組織平均數進行切片評分。

最后為組織蛋白提取：腎臟組織勻漿裂解后提取蛋白，用β 肌動蛋白為內參照，每組實驗分別重復3 遍。

1.3 觀察指標

血肌酐、尿素氮：觀察記錄三組實驗白鼠術后48h 腎臟血肌酐、尿素氮水平并進行對比。

腎組織病理改變：觀察記錄三組實驗白鼠術后腎組織病理變化并進行對比。

TUNEL 凋亡檢測：觀察記錄三組實驗白鼠TUNEL 凋亡檢測結果并進行對比。

腎組織蛋白水平：觀察記錄三組實驗白鼠腎組織蛋白水平并進行對比。

1.4 統計學分析

運用PSS23.0 統計學軟件處理數據。數值變量數據采用（）表示，采取t 檢驗或F 檢驗；無序分類數據以百分比率（%）表示，采取χ2檢驗；P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 Sham 組、IR+MSC-ex 術后48h 腎臟血肌酐、尿素氮水平與IR 組相比，均有明顯下降，且有明顯差異，有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 觀察記錄三組實驗白鼠術后48h 腎臟血肌酐、尿素氮水平并進行對比（，μmol/L）

表1 觀察記錄三組實驗白鼠術后48h 腎臟血肌酐、尿素氮水平并進行對比（，μmol/L）

注：假手術組（Sham 組），缺血再灌注組（IR 組），MSC 來源exosme 處理組（IR+MSC-ex,100μgexosme/1mlPBS）。

組別 n 血肌酐 尿素氮Sham 組 7 88±25 7.38±0.91 IR 組 7 456±34 47.52±2.91 IR+MSC-ex 7 242±32 32.98±5.61 F-255.713 212.738 P-0.000 0.000

2.2 腎組織病理改變結果：Sham 組未見組織病理損害，IR組有明顯病理損害，即表現為腎小管結構被破壞且細胞腫脹變性，腎小管管腔擴張，可見管型，且伴有腎見出血、水腫現象，炎細胞被浸潤。IR+MSC-ex 比IR 組損害較輕。

2.3 TUNEL 凋亡檢測結果：Sham 組未見明顯凋零亡細胞，IR 組凋亡腎小管上皮細胞明顯增多，管腔內存在凋亡細胞。IR+MSC-ex 與IR 組比較，凋亡細胞明顯減少。

2.4 腎組織蛋白水平結果：IR組腎組織蛋白水平明顯增高，IR+MSC-ex 相較IR 組蛋白水平有明顯降低，Sham 組無變化。

3.討論

MSC 可分化為多種細胞，且所被分化的多種細胞中都存在潛在的多能干細胞，此外MSC 具有歸巢能力。Exosme 會存在與晚期MSC 細胞的多泡體中，呈現形式是以腔內囊泡存在，在MSC 中可承擔旁分泌作用，即可在多泡體中與細胞壁融合釋放。Exosme 肉眼是無法看到的，較為規范的定義是為，直徑約在30～130mm，密度在1.13 ～1.21g/dl 之間，例如CD63/MHC 類分子。在本實驗中，是通過透射電鏡對exosme 進行觀察，并提取exosme 中結構，名為微囊小體結構，即直徑在30 ～60mm 圓形或是橢圓形，大小基本一致，通過透射鏡觀察可判斷出exosme是MSC 所分泌的來源外泌體。

在本次實驗中，正式MSC 所分泌的exosme 可對腎臟的TRI 形成保護作用，即在IRI 中，組織損傷的表現形式為細胞凋亡，繼而導致DNA 斷裂。在本次的實驗中，在出現IRI 后，TUNEL 染色陽性細胞就停留在腎小管上皮，由此可知，缺血再灌注會直接引起腎小管上皮細胞的凋亡，而IR+MSC-ex 與IR組相比凋亡細胞有明顯的較少，由此可證明，MSC 所分泌的exosme 可對腎臟IRI 后腎小管上皮細胞形成保護作用。最后在本次實驗結果中，MSC 來源exosme 可有效抑制并減輕腎損傷，而IR+MSC-ex 對腎臟無明顯保護作用，由此可知exosme作用與來源有緊密聯系，并且MSC 還可通過旁分泌細胞因子等發揮其保護作用。

綜上，大鼠中的充質干細胞（MSC）來源外泌體（exosme）可對大鼠腎臟缺血再灌注損傷有保護作用，可降低凋亡水平，改善蛋白質水平，改善腎臟水平。