人類白細胞抗原-G和干擾素γ與復發性流產相關性的初步探討

馮曉琴，曹瑩麗，郭堯，徐瑞琴，王治平，李經緯

(山西省人民醫院1.生殖醫學中心；2.婦產科；3.科教處，太原 030012)

復發性流產(RPL)是指2次及2次以上連續性發生在24周內的胎兒丟失的妊娠現象[1-2]。流行病學調查研究顯示，越來越多的育齡女性遭受RPL的困擾，并且在近年來這一現象呈現上升趨勢[3]。RPL再發風險隨流產次數的增加而上升，連續發生2次流產臨床應予以重點評估，既往RPL是導致女性后續妊娠失敗的獨立危險因素，曾有3次及以上的RPL患者再次妊娠的流產風險接近40%[4]。因此，發掘復發性流產的具體病因顯得尤為迫切和重要。然而，導致RPL的原因有很多，其中包括遺傳因素、解剖因素、內分泌因素、感染因素、免疫因素和男方因素等[5]。免疫因素導致的RPL的分子機制目前仍不清楚，但大部分趨向免疫耐受的平衡研究[6]。妊娠這一生理過程屬于半同種異體移植，從胚胎的成功種植到最后分娩整個過程需要復雜的免疫機制調控[7]。人類白細胞抗原-G(HLA-G)是一類主要組織相容性復合體(MHC)，HLA-G參與調控移植排斥反應和逃避免疫應答，可能還參與母胎界面的免疫耐受[8]。干擾素γ(IFN-γ)是一種由T1淋巴細胞(Th1)分泌的多效性因子，在參與抗病毒和免疫調節等方面有重要作用，在妊娠早期階段對血管重塑也有積極作用[9-10]。基于目前HLA-G和IFN-γ與RPL的相關性仍不清楚，雖然目前動物水平的實驗研究較多，但并沒有關于這兩個因子在RPL患者與正常妊娠者之間差異比較的分析報道。本研究通過臨床采集RPL患者和正常妊娠者的外周血和流產絨毛樣本，多角度比較RPL患者和正常妊娠者外周血以及流產絨毛組織中HLA-G和IFN-γ的表達差異，探討HLA-G和IFN-γ與RPL的相關性，為臨床診治RPL提供新的理論依據和診療思路。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年4月至2019年7月至我院生殖醫學中心和婦產科門診診治的70例流產患者為研究對象，根據流產發生的起因分組，分為RPL不孕癥患者的RPL組(n=29)和正常終止妊娠的早孕女性的對照組(n=41)。

RPL組患者納入標準：臨床確診為稽留流產的患者，超聲證實為宮內孕，未見胚芽或有胚芽但未見心管搏動，流產次數2～3次者，夫婦雙方染色體核型正常。排除標準：有家族遺傳病史、遺傳性易栓癥(PTS)、抗磷脂綜合征(APS)、內分泌疾病因素、解剖學畸形因素、宮內感染因素、男方不育因素以及環境因素(吸煙酗酒、藥物使用史等)等導致的不孕。

對照組患者納入標準：超聲顯示證實為宮內早孕，有胚芽及或原始心管搏動，既往無自然流產、死胎、畸胎等不良孕產史或有既往正常分娩健康嬰兒史，既往無妊娠期高血壓疾病、糖尿病及全身急、慢性疾病。排除標準：有家族遺傳病史、夫婦雙方或一方染色體核型異常、基礎婦科和內分泌疾病因素、解剖學畸形因素、不良環境暴露因素。

二、試劑和儀器

1.主要試劑：Trizol(15596-026，Invitrogen，美國)、氯仿(南京化學試劑有限公司)、異丙醇(南京化學試劑有限公司)、0.1% 焦碳酸二乙酯(DEPC)水(KGDN4500，江蘇凱基生物技術股份有限公司)、紅細胞裂解液(R7757，Merck，德國)、cDNA第一鏈合成試劑盒(RR036B，TaKaRa，日本)、實時定量PCR試劑盒(One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit II，RR086B，TaKaRa，日本)、酶聯免疫試劑盒(武漢默沙克生物)。

2.主要儀器：紫外光度儀(UV-2450，SHIMADZU，日本)、PCR儀(veriti 96 well thermal cycler，ABI，美國)、熒光定量PCR循環儀(step one plus real time-PCR system，ABI，美國)。

三、研究方法

1.酶聯免疫法檢測：抽取受試者空腹時的外周血5 ml于真空采血管中，靜置30 min，297g低速離心10 min，提取上清，于-80℃低溫保存待測。按照試劑盒的操作說明步驟進行。

2.外周血白細胞和流產絨毛組織總RNA提取：外周血白細胞總RNA的提取：將抗凝的外周血分別加入到1.5 ml EP管中，每管400 μl，加入預冷的紅細胞裂解液，靜置10 min，4℃離心棄上清，重復一次。將離心后白細胞沉淀加入100 μl紅細胞裂解液，輕柔吹打均勻，然后將幾管合為一管，4℃離心棄上清。加1 ml預冷的Trizol于EP管中，按照Trizol試劑步驟提取。流產絨毛總RNA的提取：將流產絨毛組織剪碎放入勻漿器中，加入1 ml預冷的Trizol，反復研磨至大部分樣品溶于Trizol中，將樣品倒入1.5 ml離心管，在室溫下放置5 min，使得核酸蛋白復合物完全分離，按照Trizol試劑提取進行。測定外周血和流產絨毛樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定濃度和純度，OD260/280在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度可以用于后續試驗。

3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測：上述提取的總RNA立即進行反轉錄或-70℃保存。cDNA第一鏈合成(20 μl體系)：總RNA(2 μg)2 μl，5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，加無核酸酶的雙蒸水至總體積10 μl，132g離心20 s，先在37℃保溫15 min，85℃保溫5 s，再置于冰上5 min。上述產物可立即進行下一步的PCR反應或-20℃保存。HLA-G、IFN-γ和內參GAPDH使用各自的引物(表1)進行擴增。擴增反應體系：稀釋10倍的cDNA模板1 μl，2×Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)10 μl，引物MIX(上游引物序列F/下游引物序列R各為10 μmol/L)2 μl，加0.1% DEPC水至總體積20 μl。擴增循環條件：95℃預變性5 min；95℃變性15～50 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，共進行40個循環。

表1 qRT-PCR引物序列

四、觀察指標：比較兩組患者的一般資料，包括年齡、體質量指數(BMI)、孕周、基礎FSH、LH、E2、HCG和孕酮；兩組患者的血清HLA-G和IFN-γ水平；兩組患者外周血白細胞和流產絨毛中HLA-G和IFN-γ的mRNA相對表達水平。

五、統計學分析

結 果

一、兩組患者的一般資料比較

RPL患者的年齡范圍為22～41歲，平均年齡(34.61±6.24)歲，孕周在12周內，平均孕周在(8.44±0.35)周；對照組患者的年齡范圍在22～38歲，平均年齡(32.83±6.14)歲，孕周在12周內，平均孕周為(8.71±1.06)周；兩組患者的年齡、孕周、BMI、基礎FSH、LH和E2水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)；RPL組患者在胎停7～8周時血清HCG和孕酮水平顯著低于對照組 (P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者的一般資料比較(-±s)

二、兩組患者外周血中HLA-G和IFN-γ水平比較

酶聯免疫法檢測兩組患者血清HLA-G和IFN-γ水平，發現RPL組的HLA-G水平顯著低于對照組，而IFN-γ水平顯著高于對照組(P<0.05) (表3)。

表3 兩組患者血清中HLA-G和IFN-γ的水平比較(-±s)

qRT-PCR法進一步檢測兩組患者外周血白細胞中HLA-G和IFN-γ的相對表達水平，發現RPL組HLA-GmRNA表達水平顯著低于對照組，而IFN-γmRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.01)(圖1)。

與對照組比較，*P<0.01圖1 兩組患者外周血白細胞中HLA-G mRNA和IFN-γ mRNA的相對表達水平

三、兩組患者流產絨毛組織中HLA-G和IFN-γmRNA表達

qRT-PCR檢測發現，RPL組流產絨毛組織中HLA-GmRNA的表達量顯著低于對照組，而IFN-γmRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.01)(圖2)。

與對照組比較，*P<0.01圖2 兩組患者流產絨毛組織中HLA-G mRNA和IFN-γ mRNA相對表達水平

討 論

IFN-γ是由Th1類淋巴細胞分泌的多效性因子，可促使毒性T淋巴細胞(CD8T)的增殖和分化，可識別病毒抗原感染的細胞以及腫瘤細胞，對其進行殺傷作用[11]。近年來的研究表明，IFN-γ可能參與妊娠早期的血管重塑和蛻膜完整性的調控[12]。但是，過量表達的IFN-γ將破壞妊娠早期母體的免疫耐受，導致胎盤形成受阻及早產等病理妊娠發生[13]。

研究發現，正常妊娠小鼠體內的IFN-γ對子宮內膜血管的重塑有積極作用[14]。Yang等[15]的研究表明，正常孕鼠妊娠13～16 d時，IFN-γ高表達有利于子宮內膜蛻膜化，創造有利于胚胎種植的內膜環境。然而本研究發現，RPL患者血清IFN-γ水平反而是顯著高于正常妊娠者(P<0.05)，提示IFN-γ因子在妊娠初期對于胚胎植入過程的影響并不完全是積極作用。Li等[16-17]研究表明，妊娠雌鼠體內IFN-γ過量表達將嚴重影響雌鼠子宮內膜容受性從而調控免疫細胞和趨化因子的異常表達最終導致小鼠妊娠失敗。本研究在人體水平上進一步證實了RPL患者外周血和流產絨毛組織中IFN-γmRNA的相對表達量均顯著高于正常妊娠女性(P<0.05)，提示妊娠早期IFN-γ因子表達異常增高可能不利于胚胎的穩定種植和妊娠維持，IFN-γ的異常波動與RPL的發生存在一定的相關性。結合本研究中的RPL女性胚胎停育大多發生在孕40～60 d左右，由此我們推測，IFN-γ在正常妊娠初期的表達可能是一個曲線走勢，即懷孕開始階段IFN-γ高表達，促進母胎界面血管重塑，幫助胚胎侵襲子宮內膜；隨著胚胎的不斷植入，在孕早期40～60 d時IFN-γ表達下調才能有效協助母體免疫自然殺傷細胞(NK)細胞蛻膜化，發揮保護胚胎的作用。本研究的RPL患者外周血和流產絨毛組織中IFN-γmRNA相對表達量均顯著高于正常妊娠者，表明在此孕期階段這些RPL患者體內的IFN-γ表達未能有效下調，因此引起母胎免疫系統耐受紊亂，對胚胎產生排斥作用而引發流產。因此，在妊娠初期，IFN-γ因子的水平可能是一個動態變化的狀態，并且在孕初期的不同階段需要維持在一個適度的范圍內，表達過低不利于胚胎侵襲和血管重塑，表達過高可能會逆轉母體免疫系統對胚胎的耐受作用，引發母體免疫系統對胎兒的排斥。妊娠早期RPL女性異常高表達的IFN-γ因子可能促使母體免疫調控向炎性方向發展，識別并排斥帶有一半父本抗原的胚胎，不利于胚胎著床和胎盤形成從而導致流產。

HLA-G屬MHC分子中的一類人類白細胞抗原-G亞型，最初是在器官移植的患者體內發現，參與免疫耐受和腫瘤逃逸[18]。HLA包括Ⅰb型和Ⅰa型這兩類亞型，HLA-G屬于Ⅰb類亞型，可促進絨毛著床和血管發育，在母體妊娠初期適量表達，可能參與穩定母胎免疫耐受。另一類亞型Ⅰa類包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，這幾類亞型屬于高度多態性MHC，主要激發對異體的排斥反應，妊娠初期需要母體的Ⅰa類HLA沉默[19]。Morandi等[20]分析表明，與Ⅰa類MHC亞型相比，HLA-G具有低多態性和嚴格的組織特異性，發現其主要存在于在母胎界面絨毛滋養層細胞、女性生殖道、卵泡液以及體外培養胚胎的培養液中，可能參與胚胎著床的免疫耐受。

Tilburgs等[21]研究發現，HLA-G和蛻膜自然殺傷細胞(dNK)之間存在短暫的微循環信號對話，參與調控母體dNK的穩定轉化，為胚胎著床準備有利的內膜環境。最新研究表明，母胎界面HLA-G是連接絨毛滋養層細胞與dNK的關鍵橋梁分子，絨毛滋養層HLA-G的穩定表達能有效激活母體dNK特異性轉錄因子同源框(PBX1)的活化，從而誘導母體大量表達多效生長因子(PTN)和骨甘氨酸(OGN)，這些促生長因子的持續作用方可維持妊娠初期胎兒的穩定發育[22-23]。這些研究從動物層面上闡述了在胚胎植入初期，HLA-G參與母胎免疫耐受的重要性，妊娠初期上游母胎界面HLA-G的穩定表達，能有效保證下游生長因子的功能。李婷等[24]用酶聯免疫法研究顯示，RPL患者血清HLA-G水平低于無自然流產史的妊娠孕婦。本研究首先比較了兩組患者血清HLA-G水平，發現RPL組患者血清HLA-G水平顯著低于對照組(P<0.05)；然后進一步用qRT-PCR比較RPL患者和正常妊娠終止者外周血和流產絨毛組織中HLA-GmRNA的相對表達量，結果發現RPL組患者的外周血和流產絨毛中的HLA-GmRNA表達均顯著低于妊娠正常維持的女性(P<0.01)。這一研究結果表明，HLA-G參與妊娠早期胚胎穩定的植入，低于妊娠維持正常水平的HLA-G與RPL的發生相關。妊娠初期，如果HLA-G表達下調，可能會影響胚胎侵入子宮蛻膜和重鑄螺旋動脈，絨毛著床不充分，嚴重影響胎盤的形成。但是，Hviid[25]研究發現，妊娠初期如果HLA-G水平過高，滋養細胞侵蝕內膜力度就會增強，可能導致滋養層細胞腫瘤發生。因此，妊娠早期HLA-G水平也需維持在一個合適的范圍之內，水平過低不利于胚胎的穩定植入和妊娠的維持，水平過高將逆轉它的積極效應，對母體產生不利影響。

Yang等[15]的研究顯示，妊娠早期IFN-γ高表達會促進MHC的表達，MHC表達上調后作用于NK，一方面使NK細胞的免疫殺傷作用失活，另一方面又能促進NK細胞分泌保護性因子白介素-2(IL-2)和白介素-4(IL-4)，從而保持了母胎免疫耐受和妊娠維持。可見，妊娠初期MHC和IFN-γ的表達之間存在一定關聯。本研究中RPL患者的外周血和流產絨毛中IFN-γmRNA表達相較于正常妊娠者異常偏高，同時HLA-GmRNA表達量偏低。綜合分析，RPL患者同時存在IFN-γ和HLA-G表達水平的失衡，我們推測RPL患者妊娠初期IFN-γ異常偏高與MHC表達也可能存在一定的關聯，IFN-γ過表達可能下調HLA-G(Ⅰb類亞型MHC)表達，同時增強HLA-A、HLA-B和HLA-C(Ⅰa類亞型MHC)表達，HLA-G的下調和Ⅰa類亞型的上調活化母體輔助性T淋巴細胞(CD4T)反應，母體免疫系統識別一半父本抗原的胚胎而產生排斥反應。我們將后續擴大RPL組的樣本量進行驗證，深入研究IFN-γ過表達對HLA-G的調控以及對下游免疫因子的影響。

綜上所述，妊娠早期在維持母胎免疫耐受平衡的過程中，HLA-G和IFN-γ因子起到關鍵性的調控作用，這兩類因子均需維持在一個合適的水平范圍內。適量的IFN-γ和HLA-G因子有利于胚胎滋養細胞侵襲內膜和妊娠的維持，在穩定母體界面的免疫耐受方面起積極作用；HLA-G和IFN-γ的表達失衡不利于胚胎種植和妊娠穩定，可能引起母體免疫系統對胎兒的識別和排斥反應從而引發流產。本研究結果可能為臨床診療RPL患者提供有意義的理論依據和參考價值。