姜黃素對肝癌細胞miR-29 及VEGF 表達的干預作用

陳彩萍 徐 琦 趙海菲

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發病率僅次于胃癌和食管癌，肝癌早期診斷率極低，浸潤轉移是HCC 術后高復發率的主要原因。浸潤轉移機制的研究對于提高肝癌早期診斷及其生存率具有重要意義[1-3]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤新生血管生長重要調控因素，文獻報道，VEGF 在肝癌組織和細胞內呈現異常高表達[4-6]。本研究觀察姜黃素對肝癌細胞miR-29 及VEGF 表達的干預作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2008 年12 月1 日—2018 年12 月1 日期間就診于杭州市腫瘤醫院臨床資料較完整的手術切除肝癌標本41 份，含癌組織和癌旁非癌組織，其中病理組織學分級Ⅰ級5 例，Ⅱ級14 例，Ⅲ級17 例，Ⅳ級5 例（由病理科醫師根據Edmondson標準[7]分級，Ⅰ～Ⅱ級為高分化，Ⅲ～Ⅳ級為低分化）。同時取10 份患者正常肝組織活檢作為對照。41 例肝癌患者中男34 例，女7 例，中位年齡50.1（23～71）歲，所有患者術前均未接受任何抗腫瘤治療。所有參與本研究者均簽署知情同意書，本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過（倫理批號：20170122）。

1.2 細胞株 LO2 人正常肝細胞（ZQ0031）、HepG2人肝癌細胞株購自于上海生化細胞所（H019）。

1.3 藥 品 姜黃素購自上海試劑二廠重慶站（分析純，批號71012660）。姜黃素溶液配制：姜黃素溶液以少量二甲亞砜（DMSO）溶解姜黃素粉劑，配成1mmol/L 溶液（儲蓄液），置于-20℃冰箱保存，實驗時用倍比稀釋配成最終濃度為7.46、14.92、29.84、59.68、119.36μmol/L 五種濃度，將肝癌HepG2 細胞制成5×104/mL 懸液，種植于96 孔培養板內，每孔200μL。實驗設試劑對照組（每孔加DMSO 20μL）、腫瘤細胞陰性對照組及五種不同濃度的實驗組（每孔加姜黃素20μL），每組平行孔位8 孔，置于37℃、5%CO2培養箱中分別培養24、48、72h 后吸取上清液，加入無血清培養液200μL，MTT 檢測細胞增殖情況。

1.4 試劑及儀器 胎牛血清（美國Gibco 公司，批號16000-044），轉錄試劑盒（MBI Fermantas 公司，批號DP441），RMPI1640（美國HyClone 公司，批號AH 30809.01），TRLzolRNA 抽提試劑盒（TOYOBO 公司，批號410800），實時定量SYBR Green PCR Master Mixture 試劑盒（TianGen 公司，批號FP202-01），逆轉錄試劑盒（QIANGEN 公司，批號34-405）、鼠抗人單克隆VEGF 一抗（福州邁新公司），生物素標記的第二抗體、SP 試劑盒、DAB 顯色劑均購自福州邁新公司；PCR 引物序列（上海吉瑪基因）：Has-miR-29上游引物：5'-UAGCACCAGCUGUGAAAUCGGUUA-3'，下游引物為：5'-CTCAACTGGTCGTGGA-3'；U6 上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；U6 下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；PCR 儀（美國Agilent 公司，型號：ProFlex），高速離心機（美國Thermo Scientific，型號：CL10），核酸定量檢測儀（美國Eppendorf 公司，型號：BioPhotometer D30）。

1.5 免疫組化檢查 將上述組織標本切片脫蠟脫水后，加入3%雙氧水中滅活內源性過氧化物酶，滴加0.01M（pH=6.0）檸檬酸鹽緩沖液于微波盒中，微波加熱至100℃進行抗原修復，分別滴加一抗（1:50）后以PBS 作為一抗陰性對照，室溫孵育60min，然后0.01M PBS 液沖洗5min，重復3 次。滴加生物素標記的二抗后蘇木素復染1min，蒸餾水沖洗3min，重復2次，切片經梯度酒精水干燥，純二甲苯透明，中性樹膠封固觀測結果。結果判定：VEGF 蛋白陽性信號呈細胞漿或胞膜棕黃色著色，觀察5 個具有代表性的高倍視野，計數陽性細胞數與總細胞數比值，其中，+為10%～25%陽性細胞；++為陽性細胞在26%～50%；+++為陽性細胞＞50%，陽性細胞數＜10%為陰性，陽性細胞數≥10%為陽性[8]。原發性肝癌的分期按國際惡性腫瘤聯盟（UICG）TNM 分類標準[7]，腫瘤直徑≤3cm 為小肝癌，＞3cm 者為大肝癌。將有癌栓和/或肝內播散和/或0.5a 內復發的HCC 患者定為低轉移復發組。

1.6 細胞培養 LO2 人正常肝細胞、HepG2 人肝癌細胞株均使用含20%胎牛血清的1640 培養基培養，在37℃、5%CO2培養箱中培養48h，鏡下觀察，細胞生長匯合度接近80%～90%時，使用0.25%的胰蛋白酶消化，進行傳代。

1.7 組織標本和細胞總RNA 抽提及RT-PCR 檢測在組織或細胞內加入適量TrizoL 后，高速研磨，4℃離心，加入異丙醇后棄上清，加入1mL 75%乙醇渦旋混勻，室溫干燥5～10min 后，加入10μL DEPC水溶解，分光光度儀測定RNA 濃度及OD 值，后續參照逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，以U6 作內參基因/核基因，將DNA 樣品用DEPC 水稀釋至50ng/μL，建立25μL 反應體系見表1。

表1 25 μL 反應體系成分及體積

RT-PCR 循環參數：預變性95℃10min；變性95℃15s，復性60℃1min，延伸72℃1min，共40 個循環；最后72℃延伸10min。每組設定6 個復孔。擴增結束后軟件分析計算DNA 相對表達量，使用7500 RT-PCR System 的分析軟件，將對照組細胞ND1/U6的比值設定為1，利用Comparative CT 方法計算目標基因相對拷貝數。

1.8 蛋白免疫印跡 細胞經過處理后加入蛋白裂解液裂解蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，調整蛋白濃度為1μg/μL，加入溴酚藍后于100℃金屬浴煮10min 使蛋白變性。吸取20μg 蛋白進行SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳，經過轉膜、5%牛奶封閉后，于4℃過夜孵育對應一抗，次日洗去一抗后室溫孵育化學二抗1h，洗去二抗后使用化學發光掃膜儀進行成像分析。

1.9 MTT 細胞增殖實驗 細胞經過轉染siRNA 24h 后，利用胰酶消化離心，利用完全培養基重懸細胞至5×104/mL。將細胞以1 萬/孔鋪板于96 孔板中，分別于0、48h 加入10μL MTT。MTT 加入2h 后利用酶標儀檢測培養基吸光度值，計算其相對吸光度值。

1.10 細胞遷移檢測 細胞轉染siRNA 24h 后，利用胰酶消化離心，利用無血清培養基重懸細胞至5×105/mL。取100μL/孔加入到transwell 上室中，下室加入600μL 培養基，于37℃培養箱中培養細胞24h，24h 后取出細胞利用4%多聚甲醛固定，擦去上室未遷移的細胞后，利用結晶紫染色，在光學顯微鏡下拍照，計算遷移細胞數。

2 結果

2.1 肝癌組織VEGF 表達 免疫組化結果顯示，41份肝癌組織標本中，VEGF 表達陽性29 份，陽性率70.73%（29/41），主要表現為細胞漿或細胞膜棕褐色著色，41 份癌旁組織中染色VEGF 表達陽性3 份，陽性率30.00%（3/10），正常肝組織均未見VEGF 陽性表達。肝癌組織VEGF 表達陽性率顯著高于癌旁肝組織和正常肝組織，差異有統計學意義（P 均＜0.01）；肝癌組織VEGF 表達與腫瘤分化程度有關，病理分級Ⅲ～Ⅳ級明顯高于Ⅰ～Ⅱ級（P＜0.05）；還與肝癌侵襲轉移性有關，高侵襲轉移明顯高于低侵襲轉移（P＜0.05）；與血清AFP 水平及HBV 無關（P＞0.05）。見表2。

2.2 VEGF 對肝癌細胞HepG2 生物學過程的影響在HepG2 細胞內分別轉染VEGF siRNA 或其陰性對照物，MTT 檢測其對細胞增殖的調控作用。結果顯示，轉染VEGF siRNA 抑制VEGF 表達后，細胞增殖受到明顯抑制，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表3）。進一步采用Western blot 檢測細胞關鍵蛋白表達改變情況，結果顯示，抑制VEGF 表達后，細胞抗凋亡蛋白Bcl-2 表達顯著下調，細胞凋亡蛋白Bax 表達顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.05）；Transwell遷移試驗結果顯示，與陰性對照組比較，抑制VEGF的表達后，HepG2 細胞遷移能力明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

表2 VEGF 蛋白表達與肝癌臨床病理學特征的關系

表3 轉染VEGF siRNA 后對細胞增殖的影響（%，）

注：VEGF siRNA（-）為VEGF siRNA 陰性對照物；VEGF siRNA（+）為VEGF siRNA；與本組0h 比較，aP＜0.05；與VEGF siRNA（-）48h 比較，bP＜0.05

圖1 VEGF 對肝癌細胞HepG2 生物學過程的影響（結晶紫染色100×）

2.3 肝癌細胞株miR-29 表達及與VEGF 的關系qRT-PCR 檢測結果顯示，LO2 正常人肝細胞系miR-29 表達較高，HepG2 人肝癌細胞miR-29 表達異常降低（P＜0.05）（見表4）；轉染miR-29 mimics 促進miR-29 表達后，VEGF mRNA 水平和蛋白質水平均顯著降低（P＜0.05）（見表5、圖2）。

圖2 miR-29 在肝癌細胞株表達及與VEGF 的關系

表4 LO2 細胞和HepG2 細胞miR-29 表達比較（）

表4 LO2 細胞和HepG2 細胞miR-29 表達比較（）

注：miR-29 為微小RNA-29；與正常人肝癌細胞LO2 比較，aP＜0.05

2.4 姜黃素對肝癌細胞抑制效應 MTT 檢測結果顯示，隨著藥物濃度增加，作用時間延長，姜黃素對HepG2 細胞的抑制率也明顯增加，72h 抑制率最好，方差分析結果顯示，五種濃度姜黃素對細胞抑制率有顯著差異性（F=73.213，P＜0.05），當姜黃素濃度為59.68μmol/L 時（接近中效濃度），72h 抑制率達54.93%。根據中效方程式計算出72h 的中效濃度IC50 為49.50μmol/L。見表6。

表5 轉染miR-29 后對VEGF mRNA 的影響（）

表5 轉染miR-29 后對VEGF mRNA 的影響（）

注：miR-29 為微小RNA-29；VEGF 為血管內皮生長因子；miR-29 mimics（-）為miR-29 mimics 陰性對照；mimics 為模擬物；與轉染miR-29 mimics（-）組比較，aP＜0.05

表6 不同濃度姜黃素對HepG2 細胞抑制率比較（%，）

表6 不同濃度姜黃素對HepG2 細胞抑制率比較（%，）

注：與24、48h 比較，aP＜0.05

2.5 姜黃素對肝癌HepG2 細胞miR-29 及VEGF mRNA 表達的影響 在肝癌HepG2 細胞內添加姜黃素59.68umol/L 作用72h 后，檢測細胞內miR-29 和VEGF 表達情況，與試劑對照組比較，姜黃素組miR-29 表達顯著升高，VEGF mRNA 表達下降，差異有統計學意義（P 均＜0.05），見表7、圖3。

圖3 姜黃素對肝癌HepG2 細胞VEGF mRNA 表達的影響

表7 姜黃素對肝癌HepG2 細胞miR-29及VEGF mRNA 表達的影響（）

表7 姜黃素對肝癌HepG2 細胞miR-29及VEGF mRNA 表達的影響（）

注：miR-29 為微小RNA-29；VEGF 為血管內皮生長因子；與試劑對照組比較，aP＜0.05

3 討論

原發性肝細胞癌（HCC）具有發展快、轉移早、預后極差等特點，臨床難點主要在于早期診斷率低，術前難以確定有無微小轉移等。VEGF 是腫瘤新生血管生成的重要調控因素之一[9-11]。研究顯示，肝癌細胞內VEGF 異常表達對于肝癌的發生發展可能存在重要意義，但具體機制仍有待進一步研究[12-14]。

本研究結果顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織VEGF 陽性率顯著增加。進一步研究VEGF 異常表達對肝癌細胞生物學過程的影響，VEGF 異常高表達可以促進肝癌細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡；轉染siRNA 抑制VEGF 表達后，細胞增殖降低，遷移減少，凋亡增加。提示異常高表達的VEGF 對肝癌細胞生物學影響顯著，而逆轉VEGF 表達可能直接影響肝癌細胞生物學過程。

MicroRNAs（miRNAs）是一類小的、進化高度保守的、內源性非編碼RNA 分子，可通過轉錄后調節調控多種基因表達。隨著表觀遺傳學研究的深入，發現其在許多重要的生物學過程包括細胞周期、分化、發育和新陳代謝方面發揮著重要作用[15-17]。文獻報道，miR-29 與VEGF 可能存在上下游關系[18-20]，提示在肝癌細胞內，VEGF 異常表達可能與miR-29 密切相關。本研究發現，肝癌細胞VEGF 異常高表達，miR-29 表達顯著低于正常肝細胞；轉染miR-29mimics 促進miR-29 表達后，VEGF 表達顯著降低，提示肝癌HepG2 細胞，VEGF 異常表達與miR-29 相關聯，miR-29 可能發揮VEGF siRNA 的作用，調控其表達，進而影響細胞生物學過程。miR-29 可能作為逆轉肝細胞異常生物學過程的潛在靶基因。

姜黃素（curcumin）是姜黃的主要活性成分之一。多項研究表明，姜黃素抗癌譜廣，毒副作用小，是一種具有廣泛應用前景的抗癌新藥[21-23]。本研究結果顯示，當姜黃素濃度為59.68μmol/L 時（接近中效濃度），對肝癌細胞72h 抑制率達54.93%，IC50 為49.50μmol/L。進一步研究發現，肝癌細胞與姜黃素共同培養時，肝癌細胞miR-29 表達顯著升高，同時VEGF 表達下降，提示姜黃素可在某種程度上促進肝癌細胞miR-29 表達，進而抑制VEGF 表達，調控肝癌細胞生物學過程。

綜上所述，姜黃素可顯著促進肝癌HepG2 細胞miR-29 表達，上調VEGF 表達，影響肝癌細胞生物學過程。但是VEGF 調控肝癌細胞的具體機制還需進一步研究。