卵泡抑素樣蛋白1 在維持結腸癌細胞生長中的作用

駱鍇冉

直腸癌作為消化道最常見癌癥之一，是全球第四大癌癥相關死亡原因，目前對于進展期結腸癌缺乏有效治療措施[1-2]。卵泡抑素樣蛋白1（follistatinlike protein 1，FSTL1）是一種細胞外分泌糖蛋白，在人體組織中廣泛表達，在細胞生存、增殖、分化和遷移以及胚胎臟器成熟過程中起重要的調節作用[3-5]。實驗研究表明，FSTL1 可促進肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細胞生長和生存[6]。本研究通過檢測FSTL1 在結腸癌細胞的表達，評估FSTL1 在體內結腸癌細胞中的作用，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人結腸癌細胞株（HT29、HCT116、DLD1）及人正常結腸上皮細胞株HCEC-1CT 購于美國模式培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 實驗動物 30 只3～7 周BALB/c 雌性小鼠，體質量（20±2）g，購自中科院上海實驗中心（許可證號：SCXK2013-0016），裸小鼠放置在層流凈化屏障系統內飼養。溫度（23±1）℃，濕度50%～60%，光照時間12h 光/12h 暗，水和飼料無限制供應。

1.3 主要試劑 吉姆薩染液和二甲基亞砜（DMSO）來源于杭州四季青公司；DMEM 培養基來源于江蘇麥莎公司；含EDTA 胰蛋白酶購自中國吉諾公司；靶向FSTL1 基因的干擾小RNA 序列設計及帶有綠色熒光蛋白的慢病毒（LV-siRNA-FSTL1）、陰性對照慢病毒（LV-siRNA-NC）和慢病毒包裝試劑盒（批號BW11002） 購自南京巴傲得生物科技有限公司；Lipofectamine TM 2000 脂質體2000（批號11668019）購于美國Invitrogen 公司；Matrix 膠（批號356234）購自美國BD 公司；BCA 蛋白水平檢測試劑盒（批號23227）購于南京凱基生物公司；p-ERK1/2（批號5284）、p-JNK（批號4223）、p-Akt（批號2764）、IκB（批號9502）和β-actin（批號9665）抗體購自美國Cell Signaling 公司，Tunel 試劑盒（批號KTA2011）購自美國Abbkine 公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 運用DMEM 培養液對細胞進行培育，同時在DMEM 培養液中添加10%胎牛血清，細胞放置細胞培養箱環境中，使用含EDTA 胰蛋白酶消化，按照1：3 的比例進行傳代。

2.2 細胞感染 將DLD1 細胞以每孔5×105個接種于6 孔板，置于孵箱培養12h，待細胞達到30%融合時將細胞分為空白對照組（BC）、陰性對照組（siRNA-NC）和siRNA-FSTL1 組。siRNA-FSTL1 組細胞感染LV-siRNA-FSTL1，siRNA-NC 組細胞感染siRNA-NC，按照Lipofectamine TM 2000 說明書進行感染，病毒液感染復數為5。病毒感染細胞16h 后去除原培養基，添加DMEM 完全培養基，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染細胞后的綠色熒光，待熒光率＞80%時收集細胞，流式細胞儀檢測感染效率，進行下一步試驗。

2.3 蛋白質印跡法 細胞在細胞裂解液的作用下提取蛋白，組織標本剔除雜質后勻漿，再經細胞裂解液作用后獲取總蛋白，總蛋白經勻漿、離心和變性等操作后，使用凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上后通過脫脂奶粉進行封閉操作，整體實驗環境為4℃，維持12h，通過一抗、二抗反應后，添加一定的化學發光液，完成顯色、曝光等處理。

2.4 建立結腸癌裸鼠異種移植瘤模型 將30 只裸鼠按隨機數字表法分為siRNA-FSTL1 組（接種穩定感染LV-siRNA-FSTL1 的DLD1 細胞）、siRNA-NC組（接種穩定感染LV-siRNA-NC 的DLD1 細胞）和BC 組（接種未感染的DLD1 細胞），每組10 只。在含Matrix 基質膠的DMEM 培養基中重懸DLD1 細胞，并將細胞懸液的密度調節至3×107/mL。將0.2mL 懸浮腫瘤細胞液皮下注射到裸小鼠的右下肢，接受注射2 周后，裸鼠異種移植瘤的體積可增至100mm3，在第4 周時終止體內實驗，取出異種移植瘤組織稱重并計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（siRNA-NC 組瘤重—siRNA-FSTL1 瘤重）/siRNA-NC 組瘤重×100%。

2.5 免疫組織化學法檢測FSTL1 和Ki-67 表達 所有樣品用5%甲醛固定過夜，用梯度乙醇脫水法將腫瘤組織進行脫水處理，石蠟包埋，切片厚度5μm。根據LSAB 染色法進行免疫組織化學染色，Ki-67 陽性表達少部分位于細胞質，大部分在細胞核中。FSTL1陽性表達大都在細胞質中，隨機選擇20 個視野并在低倍鏡下拍照，使用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件分析Ki-67 和FSTL1 在樣本中的積分光密度（IOD）值，取平均值。

2.6 Tunel 法檢測異種移植瘤細胞凋亡 用5%甲醛溶液將腫瘤組織予以固定，再經石蠟包埋和乙醇脫蠟處理，嚴格根據Tunel 染色試劑盒的說明書步驟和說明進行下一步操作，Tunel 陽性細胞表現為核固縮和棕褐色細胞核，在低倍鏡下選擇10 個視野，統計視野中Tunel 陽性細胞，取平均值。

2.7 統計學方法 應用SPSS 16.0 統計軟件完成統計分析，實驗數據以均數±標準差（） 描述，采用單因素方差分析Dunnett-t 法比較總體及總體中兩樣本均數之間差異，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 FSTL1 在結腸癌細胞表達 Western blot 結果顯示，FSTL1 蛋白在三種人結腸癌細胞株（HT29、HCT116、DLD1）表達明顯高于人正常結腸上皮細胞株HCEC-1CT 表達，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 Western blot 檢測FSTL1 蛋白在人結腸癌細胞株（HT29、HCT116、DLD1）和人正常結腸上皮細胞株HCEC-1CT的表達

3.2 慢病毒感染效率 將LV-siRNA-FSTL1 或LV-siRNA-NC 感染至DLD1 細胞后，在熒光顯微鏡下可觀察到siRNA-FSTL1 組和siRNA-NC 組細胞均有綠色熒光，慢病毒感染效率為97%（見圖2）。利用Western blot 檢測DLD1 細胞FSTL1 相對表達量，結果顯示，siRNA-FSTL1 組、siRNA-NC 組和BC 組FSTL1 蛋白相對表達量分別為（0.12±0.03）、（0.97±0.19）和（1.05±0.18），組間比較差異有統計學意義（F=35.436，P 均＜0.01），干擾效率為88.42%，見圖3。

圖2 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效率（×200）

圖3 Western blot 檢測DLD1 細胞FSTL1 表達量

3.3 沉默FSTL1 基因表達對結腸癌裸鼠異種移植瘤生長的影響 將三組腫瘤細胞分別接種裸鼠皮下2 周后即可在皮下觸及腫瘤，成瘤率100%，在第4周實驗結束時，實驗動物均未出現死亡。處死裸鼠后，將皮下腫瘤仔細剝離并稱重，三組裸鼠尸檢結果（如圖4 所示）。BC 組、siRNA-NC 組和siRNAFSTL1 組腫瘤平均質量分別為（1.15±0.26）g、（0.84±0.15）g 和（0.53±0.07）g，siRNA-FSTL1 組裸鼠異種移植瘤重量明顯低于BC 組或siRNA-NC 組，差異有統計學意義（F=6.857，P=0.002），抑癌率53.91%。

圖4 在實驗結束時，觀察各組裸鼠異種移植瘤生長

3.4 沉默FSTL1 基因表達對結腸癌裸鼠異種移植瘤組織Ki-67 和FSTL1 表達的影響 免疫組織化學法測定Ki-67 和FSTL1 在各組裸鼠異種移植瘤組織陽性表達量（見圖5）。BC 組、siRNA-NC 組和siRNA-FSTL1 組腫瘤組織Ki-67 的IOD 值分別為（125.62±20.13）、（114.61±18.72） 和（22.53±3.92），siRNA-FSTL1 組裸鼠異種移植瘤Ki-67 表達明顯低于BC 組和siRNA-NC 組，組間差異有統計學意義（F=62.517，P＜0.01）；BC 組、siRNA-NC 組和siRNAFSTL1 組腫瘤組織FSTL1 的IOD 值分別為（258.31±31.42）、（287.63±26.74）和（87.48±11.21），siRNAFSTL1 組裸鼠異種移植瘤FSTL1 表達明顯低于BC組或siRNA-NC 組，組間差異有統計學意義（F=54.652，P＜0.01）。

3.5 沉默FSTL1 基因表達對結腸癌裸鼠異種移植瘤細胞凋亡的影響 通過Tunel 法測定三組裸鼠異種移植瘤細胞凋亡，BC 組、siRNA-NC 組和siRNAFSTL1 組細胞凋亡率分別為（3.51±0.32）%、（2.93±0.44）%和（16.82±2.33）%，組間差異有統計學意義（F=65.218，P＜0.01），見圖5。

圖5 免疫組織化學法測定各組裸鼠異種移植瘤組織Ki-67 和FSTL1 蛋白陽性表達，Tunel 法測定各組異種移植瘤細胞凋亡（×400）

3.6 沉默FSTL1 基因表達對結腸癌裸鼠異種移植瘤ERK1/2、JNK、Akt 和IκB 表達的影響 感染siRNA-FSTL1 后可顯著抑制裸鼠異種移植瘤p-ERK1/2和p-Akt 表達，與siRNA-NC 組比較，FSTL1、Ki-67、p-ERK1/2 和p-Akt 相對表達量分別降低（58.42±

4.53）%、（61.61±6.82）%、（43.23±3.92）%和（47.52±5.14）%，差異均有統計學意義（P 均＜0.05）。siRNAFSTL1 對腫瘤細胞p-JNK 和IκB 表達無影響（P＞0.05），見圖6。

圖6 Western blot 檢測感染FSTL1 siRNA 后對體內DLD1 細胞中p-ERK、p-JNK、p-Akt 和IκB 表達的影響

4 討論

免疫細胞和基質細胞分泌的細胞因子對于維持結腸癌細胞生長和存活有重要的作用[7-8]。結腸癌細胞會以旁分泌/自分泌方式分泌額外的細胞因子進一步放大增殖和存活信號[9]。FSTL1 基因作為一個由308個氨基酸構成的蛋白質，廣泛分布于除外周淋巴細胞以外的機體細胞中[3-5]。同時FSTL1 在膠質瘤細胞、前列腺癌和胃癌等多種實體瘤細胞表達上調，抑制FSTL1 表達可有效降低癌細胞的多種惡性生物學行為[10-12]，但其具體作用機制尚不明確。本研究發現，FSTL1 在正常結腸細胞表達強度較弱，但結腸癌細胞株FSTL1 蛋白的相對表達量較正常結腸細胞均明顯升高，提示FSTL1 在結腸癌的發生發展階段充當著促癌基因的角色。為此，我們通過siRNA 技術特異性沉默DLD1 細胞FSTL1 表達，建立穩定低表達FSTL1的細胞株，在體內實驗中，注入裸鼠皮下組織建立結腸癌異種移植瘤裸鼠模型模擬人結腸癌生長環境，結果表明，siRNA-FSTL1 組裸鼠的腫瘤重量明顯小于BC 組和siRNA-NC 組裸鼠，表明體內慢病毒載體干擾FSTL1 表達能夠穩定地抑制結腸癌裸鼠異種移植瘤生長，進一步提示FSTL1 在結腸癌中扮演原癌基因的角色。綜上所述，鑒于FSTL1 在結腸良惡性組織及細胞中的差異性表達，以及在體內實驗中的抑瘤效應，證實FSTL1 與結腸癌的發生和發展聯系密切。

惡性腫瘤細胞的主要特征是無限增殖和抵抗凋亡能力，而促進細胞增殖和/或抑制細胞凋亡在惡性腫瘤發生發展過程中起到至關重要的作用。研究表明，FSTL1 對腫瘤細胞具有明顯促進增殖和抑制凋亡的作用，靶向干擾FSTL1 的表達可促進體外結腸癌細胞凋亡[13]；MiR-137 可靶向調節FSTL1 表達從而在維持乳腺癌細胞化療耐藥中發揮重要作用[14]。本研究中，靶向FSTL1 基因的小干擾RNA 對結腸癌裸鼠異種移植瘤生長有明顯抑制作用。此外，siRNAFSTL1 還可有效促進體內結腸癌細胞凋亡，同時抑制Ki-67 表達，從而表明FSTL1 在結腸癌細胞生長和凋亡中發揮重要作用。

ERK 作為一種脯氨酸導向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要位于細胞漿中，在諸如生長因子、激素、細胞因子、高糖和缺氧等刺激后作用下發生磷酸化，磷酸化的ERK 可進入細胞核中，最終對腫瘤細胞遷移、分化和増殖等多種生理學功能發揮調控作用[15-16]。為闡明FSTL1 控制結腸癌細胞生長的作用通路，本研究檢測改變FSTL1 表達后對體外DLD1 細胞信號通路因子表達的影響，結果表明，FSTL1 可對ERK1/2和Akt 通路發揮正向調控作用，而對JNK 和NF-κB無明顯調控作用。最新研究表明，FSTL1 在炎癥細胞中發揮作用正是通過活化ERK1/2 通路而實現[17]，本研究結果與既往研究相似，提示FSTL1 通過正向調節ERK1/2 和Akt 通路從而在結腸癌細胞增殖和凋亡過程中發揮促進作用。

總之，本研究結果表明，FSTL1 在結腸癌組織表達上調，FSTL1 與結腸癌生長和凋亡明顯相關，其作用機制可能與ERK1/2 和Akt 通路相關，但還需進一步探討FSTL1 促進結腸癌生長中的具體作用機制。