白細胞介素-6 受體及其基因突變與慢性阻塞性肺疾病相關性研究

李俏俏 鄭 靜 徐婷婷

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）被定義為可預防和治療的疾病，伴有嚴重的肺外作用，增加患者的嚴重程度風險[1-2]。白細胞介素-6 受體（interleukin-6 receptor，IL-6R）是一種模式識別受體，可與微生物表面的抗原特異性結合，從而激活補體系統。IL-6R 與COPD 急性加重相關。研究表明，IL-6R 基因編碼和啟動子區域的單核苷酸多態性對血清IL-6R 水平有功能影響，IL-6R 基因突變型AA 與兒童呼吸道感染頻率、早期感染發作及成人系統性紅斑狼瘡、高侵襲性肺炎球菌感染密切相關[3-4]，而攜帶IL-6R 變異等位基因型GG的兒童在化療期間出現發熱性中性粒細胞減少癥[5]。目前關于IL-6R 及其基因突變與COPD 相關性研究較少。本研究擬探討IL-6R 基因突變型與COPD 的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取浙江省臺州市立醫院呼吸內科2018 年3 月—2019 年10 月確診COPD 患者78 例為COPD 組，肺功能分級[6]：Ⅱ級42 例，Ⅲ級19 例，Ⅳ級11 例，Ⅴ級6 例。另取浙江省臺州市立醫院門診健康體檢者134 名作為對照組，對照組受試者肺活量測定正常。本研究經醫院倫理委員會審核通過（審批號：倫審字2018-0029），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標準 納入標準：（1）均符合COPD診斷標準[7]，無支氣管擴張、支氣管哮喘、肺癌、肺結核等其他呼吸系統疾病；（2）臨床資料完整。排除標準：（1）孕婦，近3 個月有手術、創傷史；（2）嚴重心血管疾病；（3）糖尿病、自身免疫性疾病、消化道和泌尿系統等其他感染。

1.3 主要試劑及儀器 TRIzol 試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號15596026）；PrimeScript 逆轉錄（RT） 試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號RRO37A）；EPS-100 型電泳儀（上海天能科技有限公司）；7500 型熒光定量聚合酶鏈反應儀（美國ABI 公司）；BTL-08 SPIRO 型肺功能測量儀（英國比特勒公司）。

1.4 IL-6R 基因rs4845617 單核苷酸多態性檢測根據說明使用TRIzol 試劑盒分離血液總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳確定RNA 的完整性。使用PrimeScript 逆轉錄（RT）試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，并將產物保存在冰箱中以進行下一步的實驗。采用熒光定量聚合酶鏈反應儀擴增靶基因。IL-6R 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。IL-6R 上游引物：5'-TGTGAGTCGGAGAGGCTGTGACTG-3'；下游引物：5'-CGTAACTGATTCCTCGTGACTACC-3'。探針（C）：5'-VIC-TGTGTGCGTAACTGGCGGTGC-MGB-3'；探針（T）5'-FAM-CTGGACTGACCGT-MGB-3'；所有反應設置3 個重復孔。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內部參考，通過相對定量（2-ΔΔCT 方法）計算倍數變化。PCR 條件是在94℃初始變性3min；在55℃退火，在72℃延伸35 個循環，最后在72℃延長7min，重復40 個循環，61℃時采集熒光。連接酶檢測技術檢測SNP。目的基因及內參基因的2%瓊脂糖凝膠電泳（見圖1）。變性梯度凝膠電泳檢測IL-6R 基因的rs4845617 單核苷酸多態性（見圖2）。IL-6R 基因第6 外顯子-32G/A 正向位點測序圖，見圖3。

1.5 COPD 患者肺功能指標測定 肺功能測量儀測定患者靜息狀態下用力肺活量（FVC）、一秒鐘用力呼氣容積（FEV1）、最大呼氣中段流量（MMEF）。

圖1 目的基因及內參基因2%瓊脂糖凝膠電泳

圖2 IL-6R 基因變性梯度凝膠電泳

1.6 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（） 描述，采用t 檢驗和單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q 檢驗；計數資料以例數和百分比（%）描述，采用χ2檢驗比較；多態性位點的基因型與易療效的風險分析采用二元Logistic 回歸分析，以OR 及95%CI表示相對風險度，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組與COPD 組一般資料比較 兩組受試者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

2.2 對照組與COPD 組IL-6R rs4845617 各基因型突變型比較 與對照組比較，COPD 組IL-6R rs4845617 AA 基因型比例升高，GG 基因型比例降低（P＜0.05）；與IL-6R rs4845617 AG、GG 基因型比較，IL-6R rs4845617 AA 基因型COPD 易感性明顯增加（OR=2.418、95% CI=1.748～3.345，P＜0.05）。見表2。

表1 對照組與COPD 組一般資料比較

表2 對照組與COPD 組IL-6R rs4845617 各基因型突變型比較[例（%）]

2.3 對照組與COPD 組IL-6R rs4845617 各等位基因突變頻率比較 與對照組比較，COPD 組IL-6R rs4845617 A 等位基因頻率比例升高，IL-6R rs4845617 G 等位基因頻率比例降低（P＜0.05）；IL-6R rs4845617 G 等位基因頻率比較，IL -6R rs4845617 A 等位基因頻率COPD 易感性增加（OR=2.911、95% CI=2.220～3.818，P＜0.05）。見表3。

表3 對照組與COPD 組IL-6R rs4845617 各等位基因突變頻率比較[例（%）]

2.4 COPD 患者各基因組肺功能指標比較 COPD組AG、GG 型FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平高于AA型，差異有統計學意義（P＜0.05）；GG 型FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平高于AG 型，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

圖3 IL-6R 基因第6 外顯子-32G/A 正向位點測序圖

表4 COPD 患者各基因組肺功能指標比較（）

表4 COPD 患者各基因組肺功能指標比較（）

注：COPD 為慢性阻塞性肺疾病；FEV1 為一秒鐘用力呼氣容積；FEV1/FVC 為一秒鐘用力呼氣容積/靜息狀態下用力肺活量；MMEF為最大呼氣中段流量；與AA 型比較，aP＜0.05；與AG 型比較，bP＜0.05

2.5 COPD 患者AA 基因型與疾病嚴重程度相關分析 隨著COPD 病情嚴重程度逐漸增加，AA 基因型比例逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 COPD 患者AA 基因型與疾病嚴重程度相關分析[例（%）]

3 討論

IL-6R 的突變基因型與成人和兒童呼吸道感染風險增加有關[8]。IL-6R 的外顯子中的三個多態型由230AA（密碼子54B 等位基因），239AG（密碼子57C等位基因）和223GG（密碼子52D 等位基因）組成，這些等位基因的單倍型在IL-6R 的啟動子區域具有變異，特別是在位置≥32（A/G 等位基因）[9-11]。IL-6R 在結構多態性和某些啟動子單倍型之間觀察到連鎖不平衡，并且外顯子多態性可能對血清白細胞介素-6（IL-6）水平具有更大的影響。臨床研究證實，“高生產者等位基因”IL-6R rs4845617 AA 患者會發生免疫學炎癥性疾病，例如炎癥性腸病、類風濕關節炎和系統性紅斑狼瘡[12]。IL-6R 啟動子區域AA 等位基因傾向與脂多糖刺激的IL-6 產生增加有關。攜帶AA等位基因的兒童在感染呼吸道合胞病毒后細支氣管炎的發生率明顯高于其他基因型兒童，而嚴重呼吸道合胞病毒（RSV）感染是COPD 發生的危險因素[13]。本研究發現，與對照組比較，COPD 組IL-6R rs4845617 AA 基因型比例升高，IL-6R rs4845617 AA 基因型COPD 易感性增加（OR=2.418、95%CI=1.748～3.345，P＜0.05）。表明，IL-6R rs4845617 AA 基因型與COPD 易感性相關。

研究觀察到，脂多糖刺激后IL-6R rs4845617 A表達增加[14]。在本研究中，與對照組比較，COPD 組IL-6R rs4845617 A 等位基因頻率比例升高，IL-6R rs4845617 A 等位基因頻率COPD 易感性增加（OR=2.911、95%CI=2.220～3.818，P＜0.05），也說明IL-6R rs4845617 A 等位基因在COPD 患者中更為常見。

研究發現，IL-6R 等位基因與COPD 和哮喘相關，這一發現支持這樣的觀點，即雖然哮喘和COPD是不同的疾病，但至少部分遺傳易感性可能是相同的[15]。通過對染色體2q 上的IL-6R 區域在全基因組進行篩選，結果顯示，AA 型基因能降低FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平，GG 型基因能升高FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平。本研究結果也發現，隨著慢性阻塞性肺疾病嚴重程度逐漸增加，AA 基因型比例逐漸升高，這提示AA 基因型可能加重COPD 嚴重程度。研究表明，同一地區哮喘患者IL-6R rs4845617 AA 型患者具有較高水平的血清總免疫球蛋白E（IgE）水平，而血清總IgE 水平已被證實與哮喘和支氣管高反應性有關[14]。結合本次研究結果，推測COPD 嚴重程度增加可能與IL-6R 基因突變型AA 導致的高水平IgE 有關。然而，這種推測不能排除其他候選基因位點，并且這種關聯可能是由于存在連鎖不平衡的不同易感基因導致。為排除這種偏倚，需要更多的樣本量，這將在后續研究進行。

綜上所述，IL-6R rs4845617 基因突變型AA 能增加慢性阻塞性肺疾病的易感性。