基因組測序在新型冠狀病毒研究中的應用

夏 險，李京京，董昌金，陳新鵬

(湖北師范大學 生命科學學院，國家級生物學教學示范中心，食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，特色野菜良種繁育與綜合利用技術湖北省工程研究中心，湖北 黃石 435002)

0 引言

DNA測序技術自誕生以來，經歷了三代技術的發展。第一代DNA測序技術是科學家Sanger發明的雙脫氧鏈終止法(也稱Sanger法)，該技術準確度高，測序讀長可達800bp，但其操作流程復雜，耗時長，成本高，測序不連續。熒光染料標記法和毛細管電泳技術出現后，DNA測序擺脫了對聚丙烯酰胺電泳技術和放射自顯影技術的依賴，大大提高了測序的自動化程度，使DNA測序進入全自動化時代。第二代DNA測序技術利用DNA聚合反應和熒光素酶發光反應相偶聯，實現了邊合成邊測序，提高了測序效率和測序通量，相當于一代測序的2000倍，使DNA測序進入高通量時代。但是這種測序方法的讀長短，測序費用依然昂貴，精度不如一代測序。第三DNA測序技術實現單分子DNA(RNA)通過生物納米孔的電流變化推測堿基組成而進行測序。這種測序法不受DNA聚合酶活性影響，讀長接近1Mb。目前，納米孔測序是DNA測序技術的重要發展方向，主要應用于高質量基因組的組裝，尤其是對于高雜合、高重復、大基因組等復雜基因組。

基因組是指生物體所有遺傳物質的總和，這些遺傳物質包括DNA或RNA(病毒RNA)。基因組序列是生物的重要特征之一，基因組測序是弄清未知物種的手段之一。基因組測序的核心技術是DNA測序，在作圖法和鳥槍法的多種策略的指導下，結合DNA測序技術，經過重疊群和支架拼接、縫隙填補、覆蓋面評估等過程獲取基因組序列。基因組測序不僅可以揭示物種遺傳信息，還可以預測生物的許多重要功能。目前，基因組測序從傳統的基礎研究和技術開發，已經走向醫學和臨床、農業以及生態環境等多方面的應用[1, 2]。截至歐洲中部時間2020年3月20日，全球已有266 073人確診感染新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，死亡11 184人[3]。本次COVID-19疫情中，基因組測序在病毒的發現、檢測、分類、溯源、致病機理、藥物研發等方面都發揮了十分重要的作用。

1 新型冠狀病毒的基因組

自2020年1月10日我國復旦大學學者公開新型冠狀病毒的基因組序列以來，截至到2020年3月22日，中國、美國、日本、泰國、英國、法國等國家已經陸續公布了1077條新型冠狀病毒的序列[4]。目前，公布的COVID-19基因組大約為29.9Kb，共含Orf1ab(復制酶復合體)、S(刺突蛋白)、3、E(小包膜蛋白)、M(包膜糖蛋白)、7、8、9、10b、N(核衣殼)、13和14在內的12個編碼區[5]。

2 基因組測序在COVID-19的病原鑒定和檢測中的應用

COVID-19的病原最先由我國學者高福院士團隊發現，通過宏基因組的方法在3例不明肺炎的患者支氣管肺泡灌洗液樣本中檢測到，是一種與此前報道的重癥急性呼吸道病毒(SARS)相似性較高的病毒[6]。隨后，該團隊從樣本中分離到病毒株，并通過納米孔測序和Sanger法測序相結合的方法獲得了該病毒的基因組。經序列分析，該病毒與已報道來源于蝙蝠的SARS類似病毒的相似性為86.9%，是一種新型冠狀病毒[6]。

圖1 新型冠狀病毒的進化分析[12]

宏基因組測序和全基因組測序都可以用于病毒檢測，但需要花費大量的時間和較高的經濟成本。實時定量RT-PCR由于靈敏度高，成本低和檢測速度快，在病毒檢測方面具有很大的優勢，是目前病毒檢測最常用的手段。在此方法檢測過程中，設計靶向新型冠狀病毒基因組的引物是前提。中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所最先針對該病毒的Orf1ab和N兩個靶基因設計了實時熒光RT-PCR的引物和探針[7]，具有較高的靈敏度和特異性。德國科學家Victor Corman根據該基因組特點，選取該病毒的Orf1ab和E兩個基因為靶點，分別設計了兩對引物和兩個熒光探針，利用RT-PCR實驗方法，理想狀態下檢測極限分別為3.8份RNA 拷貝和5.2份RNA拷貝，顯示了該引物和探針的高特異性，同時也排除了冠狀病毒科α病毒、β病毒的成員和以及常見的呼吸道病毒干擾，進一步說明該方法的有效性[8]。Cao bin等人抽取41名疑似患者的血液，選取了該病毒的靶向Orf1ab和N基因引物，利用實時熒光定量RT-PCR和基因組測序結合的方法，對這些患者進行了確診，分析了這些患者的臨床特征。同時該研究還暗示，武漢海鮮市場可能不是新型冠狀病毒的唯一源頭[9]。美國、日本、泰國、法國也根據新型冠狀病毒的特異基因序列設計了引物和探針用于RT-PCR檢測[10]。最近，有學者根據新型冠狀病毒的刺突蛋白抗原基因序列，與SARS病毒對應的抗原序列比對，發現兩者的刺突蛋白抗原具有高度同源性，預測這兩種抗原空間表位具有相似性，制備了與新冠狀病毒結合的抗體，運用開發病毒檢測的 ELISA試劑盒[11]。

3 基因組測序在新型冠狀病毒分類和溯源中的應用

明確病毒分類地位能讓人們更好地認識病毒，根據對親緣關系較近病毒的積累研究，可以為新型病毒的防治提供經驗。基因組測序和序列比對是確定病毒分類地位的快速有效方式。通過對新病毒基因組測序，明確新型冠狀病毒屬于套式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬。冠狀病毒屬由α、β、γ和δ四個亞群組成，哺乳動物是α和β兩個亞群的主要宿主。如圖1，基于病毒的全基因組序列構建的進化樹顯示，新型冠狀病毒與β-冠狀病毒的SARS-CoV、MERS-CoV、HcoV-HKU等病毒屬于同一類群，但獨成一支[12]。分析表明新型冠狀病毒屬于β-冠狀病毒屬，不同于β-冠狀病毒屬的已知病毒。由于新型冠狀病毒的高致病性，國際病毒分類委員會命名其為嚴重性呼吸綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。該病毒與SARS-CoV的全基因組相似性只有79.5%，但是一些保守結構域的氨基酸序列相似性很高[13]。顯示SARS-CoV-2與SARS-CoV同屬，但并不是同一個物種。

找到傳染源是病毒防治的最重要工作之一，病毒基因組的溯源分析是找到傳染源和傳染路徑的重要方法。根據全基因組序列比對和進化分析，發現SARS-CoV-2與一種蝙蝠攜帶的冠狀病毒的全基因組序列相似度高達96%，表明SARS-CoV-2很可能來自蝙蝠[13，14]。盡管基因組相似度很高，但是編碼病毒受體結合域的基因序列相似性低。隨后研究者從穿山甲中分離到了與SARS-CoV-2全基因組相似度高達99%的病毒株，而且病毒受體結合域的相似度也很高，這表明中間宿主可能是穿山甲[15，16]。但是，也有報道指出SARS-CoV-2可能并非直接來源于穿山甲[17]。基于基因序列分析，研究者還發現SARS-CoV-2病毒在不斷的傳播中進化成L型和S型(圖2)，在武漢早期流行的L型可能起源于S型[18]。也有學者將SARS-CoV-2分為I型(包括IA型和IB型)和II型，在武漢流行的II型可能起源于I型[19]。這些基于基因組序列比對的研究，都暗示著在全世界流行的SARS-CoV-2起源可能比較復雜。

圖2 COVID-19的單倍型分析(藍色代表L型，紅色代表S型)[18]

4 基因組測序結果在新型冠狀病毒致病機理研究中的應用

刺突蛋白(S蛋白)是病毒進入細胞的關鍵受體結合蛋白。研究者通過公布SARS-CoV-2的基因組數據，注釋后獲得S蛋白的氨基酸序列，再根據氨基酸序列預測了該蛋白的結構(圖3)[12]。結果表明刺突蛋白很可能與人體細胞的受體血管緊張素轉換酶(ACE2)結合[12]。預測結果還發現，SARS-CoV-2的S蛋白具有一個可區別于SARS-CoV和SARS-CoV類似病毒的酶解敏感的活化環，可能在致病過程中發揮作用[20]。隨后，科學家通過冷凍電鏡技術解析了S蛋白和ACE2蛋白結合的晶體結構，證明了這兩個蛋白不僅可以結合，而且比SARS-CoV結合能力強[21，22]。這可能是SARS-CoV-2致病性更強的原因之一。另外，也有研究者發現SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白受體結合域的序列存在一定差異，提示SARS-CoV-2與SARS-CoV致病機理有差異，也解釋了與SARS-CoV特異性單克隆抗體結合能力弱的原因[23]。

圖3 基于基因組預測的S蛋白結構及ACE2結合域[12]

5 基因組序列對新型冠狀病毒藥物研發的指導作用

通過對新冠狀病毒的基因組序列分析，發現該病毒的刺突蛋白和4種非結構蛋白(3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶、木瓜蛋白酶樣蛋白酶、解旋酶和RNA依賴性RNA聚合酶)在病毒增殖過程中起到關鍵性作用。這5種蛋白被認為是藥物研發的重要靶標，其中4種新冠病毒酶的催化位點具有高度保守性，與已發現的SARS-Cov和MERS-CoV序列具有高度的相似性。研究分析表明抗SARS-Cov和MERS-CoV的藥物口袋具有保守性，很多針對這類病毒的藥物對COVID-19同樣具有治療效果[24]。這些藥物包括兩類，一類是針對參與RNA病毒侵染或者增殖過程中的酶抑制劑(如法匹拉韋、利巴韋林，瑞德西韋等)、蛋白酶抑制劑和刺突糖蛋白抑制劑[25～28]；還有一類藥物是核酸類藥物，通過與這些酶的mRNA結合，抑制蛋白翻譯過程。研究者利用生物信息學方法比對基因組序列，發現SARS-CoV-2的S蛋白、E蛋白或其他蛋白均存在良好的抗原表位，為開發有效疫苗及中和抗體提供了理論支持[29～31]。基于基因組序列信息，最近科學家還設計了新冠病毒的mRNA疫苗，并已進入臨床試驗，其機制是將編碼新冠病毒刺突蛋白的mRNA導入人體細胞，使細胞表達抗原蛋白，再通過該抗原刺激免疫系統，期望盡快獲得病毒的抗體[32]。

6 結語與展望

自COVID-19在全球爆發以來，基因組測序技術以特異性高、檢測速度快和低成本的優勢，在疫情防控、防治等方面起到重要作用。當前新型冠狀病毒的溯源、傳播機制、藥物和疫苗研發等方面還有待深入研究，基因組測序技術仍然可以發揮不可替代的作用。