微氧對‘赤霞珠’干紅葡萄酒香氣的影響

張軍翔，張眾

（1. 寧夏大學葡萄酒學院/葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心/寧夏葡萄與葡萄酒工程技術中心，寧夏銀川 750021；2. 寧夏大學生命科學學院，寧夏銀川 750021）

香氣是衡量葡萄酒品質和風格的重要指標之一，葡萄酒的香氣特征是由酒中揮發性成分的種類、含量及其揮發能力所決定。盡管人們已經從葡萄酒中檢測出上千種揮發性成分[1]，但是在葡萄酒風味研究領域，只有幾十種主要的香氣成分才是人們關注的重點[2]，而這些香氣成分的組成和比例受葡萄品種、氣候土壤、栽培方式、釀造工藝、陳釀環境等因素的影響，在不同葡萄酒中存在差異[3]。在陳釀過程中，葡萄酒香氣成分含量會發生緩慢而持續的變化，伴隨著香氣的感官特征也發生變化，這種變化受一些陳釀工藝所調控，例如近些年來興起的微氧（Micro-oxygenation, MOX）技術。

微氧工藝是指在人為可控的前提下，持續性或間歇性向葡萄酒中通入微量氧氣以促進其成熟并提升其感官品質的技術。該技術于上世紀90年代初期由Patrick等在法國南部產區提出并應用于生產實踐，于1996年經歐盟委員會批準得以合法使用[4]。微氧技術的發明，起初的目的是加快葡萄酒成熟并取代橡木桶的使用[5]，因為適量氧氣能夠促進酚類物質發生聚合反應，有效提升葡萄酒顏色的穩定性和口感的柔和度[6-9]，也能夠改善葡萄酒的香氣品質[10]。國外的研究表明，微氧處理有利于減弱葡萄酒還原味和生青味的氣味類型[6,8,11]，增強果香味、香料味、堅果味、煙草味等香氣特征，提升香氣的復雜度[12-13]。

由于微氧技術在改善葡萄酒感官品質的同時，使葡萄酒的陳釀更加精確可控，有效縮短陳釀時間，并節約橡木桶的使用成本，因而得到行業的充分認可[14]。目前，該技術已經被廣泛應用于世界多個葡萄酒產區[15-16]。盡管我國專家學者對微氧技術的研究相對較早[14,17]，但是相關研究主要側重于探究微氧對葡萄酒的顏色、口感以及與之相關的酚類物質的影響[18-21]，而對葡萄酒香氣調控的研究相對較少[22]。本研究以賀蘭山東麓‘赤霞珠’干紅葡萄酒為試驗酒樣，在陳釀期間對葡萄酒進行微氧處理，探究該技術對葡萄酒揮發性成分以及香氣感官特征的影響，為微氧工藝在國內的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘赤霞珠’葡萄原料于2018年10月8日采收自寧夏大學葡萄酒學院葡萄園。葡萄含糖量為211.3±0.9 g/L，總酸為6.1±0.1 g/L，pH為3.49±0.01。

Vinozym vintage FCE果膠酶、Excellence XR活性干酵母、Oeno 1乳酸菌干粉、偏重亞硫酸鉀，法國Lamothe-Abiet公司；次甲基藍、酚酞、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、鄰苯二甲酸氫鉀、氯化鈉、氯化鉀（均為分析純），天津市天力化學試劑有限公司；無水乙醇（≥99.8%，GC），上海阿拉丁試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇（≥98.0%，GC），日本TCI公司；C8-C20正構烷烴（≥99.7%，GC），美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

TU-1901型分光光度計，北京普析儀器有限責任公司；雷磁PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；Enology Y15葡萄酒全自動分析儀，西班牙Biosystems公司；7890B型氣相色譜儀、7000D型三重四級桿質譜儀、DB-WAX色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm），美國Agilent公司；DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm, 1 cm），美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒釀造

葡萄采收后立即進行分選、除梗、破碎，轉入200 L不銹鋼發酵罐，入料過程中均勻添加20 mg/L果膠酶和80 mg/L偏重亞硫酸鉀，次日接種200 mg/L商業釀酒酵母啟動發酵。發酵溫度26～28 ℃，期間每天淋帽3次，每次10 min。發酵結束后繼續浸漬3 d，將壓榨汁與自流汁混合均勻。原酒主要理化指標如下：酒精度13.9±0.1 %vol，干浸出物30.2±0.2 g/L，游離SO210.5±0.9 mg/L，殘糖1.50±0.03 g/L，可滴定酸6.1±0.0 g/L，pH 3.73±0.01。

接種10 mg/L的商業乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發酵。蘋-乳發酵完成后添加120 mg/L偏重亞硫酸鉀，密封并靜置于酒窖中穩定3個月（溫度16±2 ℃，濕度65±5%）。

1.3.2 微氧處理

在氮氣保護下將穩定后的酒樣分裝于5 L加州瓶中，用食品級硅膠塞封口。設置1個對照組CK（密封，不通氧）和3個濃度水平的微氧處理，分別標記為M-0.5、M-1和M-2，對應的通氧量為每月0.5、1、2 mL/L。微氧處理方式借鑒Pechamat等[23]的方法，通過注射器將一定體積的純氧注入瓶內。操作完成后，緩慢輕搖瓶身數次，保證氧氣充分溶解，在氮氣保護下擰緊螺旋蓋，封口膜封口，通氧周期為每6天1次，每月5次。所有組均為3個重復，試驗處理持續4個月。

1.3.3 理化指標分析

酒精度、干浸出物、還原糖、可滴定酸（g/L，以酒石酸計）、揮發酸（g/L，以乙酸計）依據GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；pH通過雷磁PHS-3C型pH計測定；總酚（g/L，以沒食子酸計）、總花色苷、總硫、游硫通過Enology Y15葡萄酒全自動分析儀測定；總單寧通過鹽酸示差法測定[24]；色度值取420、520、620 nm處吸光值之和，色調值取420 nm與520 nm處吸光值之比。

1.3.4 香氣成分分析

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（Head space-solid phase micro-extraction hyphenated with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS）技術對葡萄酒香氣成分進行檢測，檢測方法以Hjelmeland等[25]的研究為基礎并加以優化，具體如下：

稱取1.5 g NaCl于20 mL頂空瓶中，加入5 mL酒樣，再加入10 μL 4-甲基-2-戊醇（1.0083 g/L）作為內標，密封頂空瓶，置于CTC自動進樣器；萃取頭老化溫度250 ℃，振搖器40 ℃預熱5 min，振搖速度250 r/min，樣品40 ℃萃取30 min；不分流模式進樣，進樣口240 ℃解吸10 min；載氣高純氦氣（純度≥99.999%），流速1 mL/min，起始柱溫40 ℃，恒溫5 min，以3 ℃/min升溫到97 ℃，保持7 min，以2 ℃/min升溫到120 ℃，再以3 ℃/min升溫到150 ℃，最后以8 ℃/min升溫到220 ℃，保持10 min；質譜接口溫度230 ℃，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，溶劑延遲4.4 min。

以掃描模式定性（35～300 m/z），提取質譜圖在NIST 17標準譜庫中檢索，并計算香氣成分的保留指數[26]，與文獻值對比；以SIM模式定量，每種香氣成分選擇3個特征離子，香氣成分的濃度以香氣成分的峰面積與內標峰面積的比值，再乘以內標的濃度來表示[27-28]。

1.3.5 香氣感官分析

14名品嘗員由寧夏大學葡萄酒學院SA感官品評小組成員以及寧夏大學葡萄與葡萄酒學研究生組成，每位品嘗員均接受過系統的葡萄酒感官分析訓練，并且對賀蘭山東麓葡萄酒較為了解。香氣感官分析采取盲品的形式，參考Tao等[29]的方法，對10類氣味特征（生青味、果香味、果脯味、花香味、香辛料味、菌菇味、中藥房味、堅果味、動物味、木質味）進行定量描述分析，氣味特征感知強度的評分依據如下：0分，無此類香氣；1分，微弱且較難分辨；2分，能分辨但較微弱；3分，容易分辨但不夠強烈；4分，容易分辨且強烈。香氣特征的修正頻率（Modified frequency，MF）表示如下：

其中，F(%)表示某類氣味特征的感知頻率。為避免個體誤差，本研究將F(%)＜20%的數據視為無效值（計為0%）；I(%)表示某類氣味特征感知強度的平均值相對于總分的百分比。

1.3.6 數據處理及統計分析

數據平均值和標準偏差的計算、單因素方差分析、相關分析均通過R3.4.1軟件來完成，繪圖通過Origin 2018軟件完成。

2 結果與分析

2.1 微氧對葡萄酒釀酒學參數的影響

釀酒學參數是了解葡萄酒基本品質的關鍵，微氧處理后葡萄酒的各項基本理化參數、酚類指標和顏色指標如表1所示。由表1可以看出，不同濃度的微氧處理對酒度、干浸出物、殘糖、可滴定酸、pH值均無顯著性影響，但是最高濃度的微氧處理（M-2）顯著提升了酒樣的揮發酸含量，可能會對葡萄酒品質產生一定的影響。SO2是葡萄酒生產和儲藏過程中最為重要的外源抗氧化劑，游離態SO2具有很強的抗氧化性，通常以HSO3-形式存在于葡萄酒基質中，能夠與H2O2和醌類物質等氧化劑或氧化中間產物發生反應，對其他成分具有一定的保護作用[30-31]。由表1可知，微氧處理濃度越高，總SO2和游離SO2的含量越低，其中最高濃度的微氧處理（M-2）導致了游離SO2含量過低，因此，在進行微氧處理的過程中要時刻監視SO2含量的變化，防止過度氧化。酚類物質是葡萄酒主要成分之一，決定了葡萄酒的顏色和口感。本研究發現，微氧處理后葡萄酒中總酚、總單寧、總花色苷含量以及色調值均表現出降低的趨勢，而色度值則顯著提升。

2.2 微氧對葡萄酒香氣成分的影響

運用SIM模式對酒樣中49種香氣成分進行定量，包括脂肪醇、C6醇、芳香醇、甲酯、乙酯、異戊酯、乙酸酯、醛、酮、萜烯等類物質，各成分的保留指數和SIM定量離子詳見表2。

由于香氣成分種類繁多，依照Ortega-Heras等[32]的方法，對包含成分數目較多，且組內成分的化學結構和官能團特性具有相似性的組分（脂肪醇、乙酯、異戊酯、乙酸酯）按總量進行分析，對其他幾組按各成分含量一一進行分析，結果見表3。

表1 微氧處理對葡萄酒釀酒學參數的影響Table 1 Effect of micro-oxygenation treatments on oenological parameters of wine

表2 香氣成分的分類、保留指數、SIM定量離子Table 2 The classification, retention indices, and selected ion monitoring qualifying ions of aroma compounds

高級脂肪醇是葡萄酒中重要的風味物質，其濃度低于300 mg/L時能夠增強葡萄酒香氣的復雜度，但超過400 mg/L時則會給葡萄酒帶來酒精味、辛辣味、雜醇油味等不良氣味特征[32]。由表3可知，在陳釀期間對葡萄酒進行微氧處理，脂肪醇含量雖然有一定程度的增加，但是增加量均未達到顯著性水平，而且含量仍然低于300 mg/L。

C6醇（己醇、葉醇）是葡萄酒中一類具有生青味特征的醇類物質。盡管微氧的作用之一是去除葡萄酒的生青味，但是本研究表明，不同濃度微氧處理對酒樣中己醇和葉醇的含量均未產生顯著性的影響。

芳香醇具有令人愉悅的香氣特征，2-苯乙醇是葡萄酒中含量最高也是最為重要的芳香醇，酵母菌可以通過莽草酸途經和艾氏途徑兩條代謝途徑合成2-苯乙醇[33]。由表3可知，不同濃度微氧處理后的酒樣中2-苯乙醇的含量均有一定程度的提升，盡管在統計學上與對照組未達到顯著性差異水平，但是增加量達到了12.73%～21.90%。苯甲醇也是葡萄酒中常見的芳香醇，但是與2-苯乙醇相比，苯甲醇的濃度較低，對葡萄酒香氣的貢獻程度也較小，微氧處理后其含量會有一定程度的降低。

酯類物質能夠給葡萄酒帶來果香味的香氣特征。相關研究表明，微氧處理對酯類物質含量不會產生明顯的影響[11,32]。本研究表明，陳釀期間適宜濃度的微氧處理（M-0.5、M-1）不會對酒樣中乙酯、異戊酯、乙酸酯的含量產生顯著性的影響，但是較高濃度的微氧處理（M-2）會顯著降低以上各類酯的含量，可能會導致葡萄酒果香味的損失。

對于羰基化合物而言，不同濃度的微氧處理均顯著提升了酒樣中苯甲醛、雙乙酰（2,3-丁二酮）和2,3-戊二酮的含量，而且通氧濃度越高，增加量越大。苯甲醛含量的提升，可能與苯甲醇的氧化相關。雙乙酰與2,3-戊二酮具有相似的官能團和化學性質，二者均具有黃油和奶油的氣味特征[34]。

里哪醇和香茅醇都是葡萄酒中較為常見的萜烯類物質，通常以結合態形式存在于葡萄漿果中，在發酵和陳釀過程中經酶促或非酶促反應被釋放出來，具有花香味和柑橘味的香氣特征[34-35]。由表3可以看出，陳釀期間適宜濃度的微氧處理（M-0.5、M-1）不會對酒樣萜烯類物質的含量產生顯著性影響，但是最高濃度的微氧處理（M-2）會顯著降低香茅醇的含量。

苯乙烯含有乙烯基不飽和鍵，易發生氧化反應。本研究發現，所有濃度的微氧處理均能夠顯著降低酒樣中苯乙烯的含量。由于苯乙烯具有汽油味等不愉悅的氣味特征[34]，因此其含量的降低可能會對葡萄酒的香氣品質產生比較好的影響。

從總的香氣含量來看，陳釀期間適宜濃度的微氧處理（M-0.5、M-1）會一定程度上提升酒樣香氣成分的總體含量，而較高濃度的微氧處理（M-2）則有可能會降低香氣成分總量，但是差異均未達到顯著性水平。

2.3 微氧對葡萄酒香氣感官特征的影響

2.3.1 香氣感官特征的變化

經微氧處理后，葡萄酒香氣成分的含量發生了變化，所以香氣的感官特征也會受到一定的影響。本研究采用定量描述分析法對酒樣的10類氣味特征進行定量描述分析，以MF值為評價依據，結果如圖1所示。

由圖1可以看出，所有酒樣的生青味、果香味、果脯味、花香味和香辛料味的MF值均較高，說明這幾類氣味特征是酒樣較容易被感知的氣味類型。M-0.5酒樣生青味的MF值略低于CK，M-1、M-2酒樣生青味的MF值均明顯低于CK，說明微氧處理有利于減弱葡萄酒的生青味。所有微氧處理酒樣的果香味也有所減弱，可能與酯類物質含量的降低具有一定的關系（表3）。微氧處理后酒樣的果脯味均得到了加強，但是最高濃度微氧處理組酒樣（M-2）果脯味的MF值遠遠高于CK和其他兩組處理（M-0.5、M-1），但是果脯味過高可能會影響葡萄酒香氣的協調性。與果脯味的變化情況類似，微氧處理后所有酒樣的花香味均有一定程度的提升，能夠增強葡萄酒香氣的優雅度，其中每月1 mL/L的微氧處理（M-1）對花香味的提升作用最為明顯。通過微氧處理，酒樣的香辛料味有小幅度的減弱。

雖然其他幾種氣味類型的MF值相對較低，但是它們對葡萄酒香氣的復雜度會起到一定的作用。由圖1可知，不同濃度的微氧處理對葡萄酒菌菇味和中藥房味的影響沒有表現出一致性規律，但是對堅果味的香氣特征均有較明顯的增強，對動物味的氣味類型均有不同程度的減弱（動物味并不一定能被所有消費者所接受）。由于本研究供試酒樣始終未接觸橡木制品，所以所有酒樣均未感知出木質類氣味，這也說明了本試驗在探究微氧對葡萄酒香氣的單因素作用時并未受到橡木香氣的影響。

2.3.2 相關性分析

利用相關分析進一步探究微氧處理后葡萄酒香氣感官特征的變化與香氣成分變化之間的關系，結果見圖2。由圖2可知，生青味的變化與C6醇（己醇、葉醇）含量之間并無明顯的相關關系，雖然生青味與酯類物質、乙偶姻和香茅醇具有較強的相關性，但是目前并沒有研究表明這些物質能夠給葡萄酒帶來生青味[34]。果香味與乙酯、異戊酯和香茅醇均呈顯著正相關，這是因為酯類物質能夠給葡萄酒帶來紅色水果和黑色水果的香氣特征，而萜烯類物質也具有熱帶水果的香氣[34-35]。雖然微氧處理后酒樣的果脯味有所增強，但是沒有任何一種香氣成分與果脯味的增強呈顯著正相關關系，所以果脯味可能是葡萄酒中多種香氣成分共同作用的結果[34]?；ㄏ阄兜脑鰪娕c2-苯乙醇含量的增加具有顯著正相關關系，這是由于2-苯乙醇具有玫瑰花和丁香花的香氣特征[34,36]，而且由表3可知，2-苯乙醇在酒樣中含量較高，受微氧的影響也較為明顯。香辛料味的變化與苯甲醇、酯類物質、乙偶姻、萜烯類物質和苯乙烯含量的變化均具有較強的正相關關系，但均未達到顯著性水平。菌菇味、中藥房味以及動物味與各種香氣成分均沒有很好的相關性，這幾類香氣特征的主要呈香物質仍需進一步探究。此外，微氧處理后堅果味的增強與苯甲醛、雙乙酰和2,3-戊二酮含量的增加均具有顯著正相關關系。

圖1 酒樣香氣特征的修正頻率值Figure 1 The modified frequencies of aroma characteristics of wine samples

圖2 香氣特征和香氣成分的相關矩陣Figure 2 The correlation matrix between aroma characteristics and aroma compounds

3 討論與結論

在陳釀過程中，幾乎所有葡萄酒的成熟都與氧相關，并通過氧化還原反應實現，氧氣也是調控葡萄酒香氣演化的最重要的因素之一[37-38]。微氧技術作為一種新興的葡萄酒陳釀工藝，能夠實現陳釀期間的精準供氧，對葡萄酒的成熟控制具有十分重要的意義。國內早期的研究探究了微氧對葡萄酒酚類物質、顏色以及口感的影響，在此基礎上，本研究以賀蘭山東麓‘赤霞珠’干紅葡萄酒為試材，主要探究了微氧技術對葡萄酒香氣成分和香氣感官特征的影響。

試驗結果表明，在陳釀期間對葡萄酒進行微氧處理，能夠一定程度上提升高級脂肪醇的含量，但提升幅度較小，不會對葡萄酒香氣品質產生不良的影響[32]。盡管C6醇具有生青味的氣味特征，同時感官分析也表明，微氧處理后葡萄酒的生青味有所減弱，但是不同濃度水平的微氧處理均沒有對C6醇含量產生明顯的影響，而且本試驗與前人的研究均未證實C6醇與生青味的變化具有較強的相關性，因此生青味的減弱可能與其他成分相關[4,12,32]。微氧處理后，葡萄酒的2-苯乙醇含量有較大幅度的提升，盡管在統計學上與對照組未達到顯著性差異水平，但是從感官分析層面上能夠推斷2-苯乙醇含量的提升可能是導致葡萄酒花香味增強的原因之一。微氧處理后葡萄酒的酯類物質含量、香茅醇含量和果香味的MF值都有所降低，尤其是最高濃度微氧處理組酒樣（M-2）的降低幅度最為明顯，這表明在進行微氧處理時，通氧濃度一定要適宜。這是因為氧氣會誘導葡萄酒產生自由基和醌類物質，前者會破壞酯類物質和萜烯類物質結構，后者會直接與它們發生反應[13,37]。微氧處理后葡萄酒中苯甲醛、雙乙酰和2,3-戊二酮的含量均有顯著性的提升，結合感官分析可知，這些成分含量的提升可能是導致葡萄酒堅果味香氣特征增強的原因之一[34,39]。此外，感官分析還發現，微氧處理后葡萄酒的果脯味有所增強，香辛料味和動物味有所減弱，但是導致這些氣味特征發生變化的主要呈香物質仍需進一步探究。

在評價葡萄酒香氣變化之前，本研究也探究微氧處理對葡萄酒基本釀酒學參數的影響。結果表明，微氧處理并不會對葡萄酒酒度、干浸出物、殘糖、可滴定酸、pH值等基本理化指標產生影響，與康文懷等[17-18]、王麗萍等[22]的研究結果相一致。但是較高濃度的微氧處理（M-2）會提升揮發酸的含量，而且也會過量消耗葡萄酒中的SO2，帶來過度氧化的風險。同時，本試驗也表明微氧處理導致葡萄酒酚類物質含量降低和色度值提升，結合前人的研究可以推斷[4,5,8]，這是由于微氧促進了花色苷與單寧等物質的聚合反應，從而提升葡萄酒顏色的穩定性。