葡萄與葡萄酒中細胞壁的研究進展

高宇，袁華璐，繆榕，薛飛，宋士任，葉文秀，盧江*

（上海交通大學農業與生物學院葡萄與葡萄酒研究中心，上海 200240）

細胞壁作為植物細胞的一個重要組成部分，除能有效保護細胞的完整性外，還被發現參與生命體諸多活動，如控制細胞間物質運輸、參與信號傳導、逆境調控[1]。在葡萄的生長發育中，其果實的形成、膨大、成熟包含上百種酶參與了細胞壁的合成、修飾與降解途徑。細胞壁的組分、結構對果實的質地口感起關鍵性作用[2]，而細胞壁內部大分子的結構修飾也會改變其與呈香物質、酚類物質的結合狀態，從而進一步影響果實的品質[3]。成熟采收時的果實細胞壁狀態很大程度上影響后續釀造工藝的選擇與實施。因此，對葡萄果實細胞壁精確的組分與結構分析，是回答各種科學問題的前提。然而細胞壁結構的復雜性，各物種、品種、組織、發育階段下的差異性也為檢測帶來很大的挑戰。

細胞壁主要成分包括數十種單糖組成的纖維素、半纖維素、果膠、糖蛋白大分子等。而在每一重要組成成分下，由于主鏈、支鏈的細微差異，又含有諸多結構各異的大分子，如半乳糖醛酸聚糖、鼠李糖半乳酸醛酸聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯糖木葡聚糖等。以往的研究逐步驗證了其中部分大分子的特性和其對細胞壁結構特性和功能的潛在影響[4]。

1 細胞壁檢測的歷史、挑戰與創新

細胞壁被公認為自然界最復雜的結構之一，由于分析技術的原因，對細胞壁層面上微妙復雜并且迅速變化的分析一直是個充滿挑戰的領域。細胞壁中的多糖不像基因與蛋白質一樣被測序分析、合成并表達，因此，細胞壁分析技術的發展相對緩慢，一些傳統技術（如氣相色譜質譜分析單糖）直到今天還在應用。近年來，免疫生物學與檢測設備的快速發展給細胞壁研究帶來突破的契機，從不同角度提供高通量的檢測數據，結合多元數據分析方法，為未來的研究提供了新的思路。以下簡要總結細胞壁研究的主要檢測技術以作比較。

1.1 色譜法

色譜法在葡萄細胞壁組分分析中有很長的歷史，其中主要包括對單糖組分分析的氣相色譜。細胞壁多糖主要包含7種中性糖：阿拉伯糖（Arabinose）、鼠李糖（Rhamnose）、木糖（Xylose）、甘露糖（Mannose）、巖藻糖（Fucose）、半乳糖（Galactose）、葡萄糖（Glucose），以及2種酸性糖：葡萄糖醛酸（Glucuronic acid）和半乳糖醛酸（Galacturonic acid），按照不同的鍵位形式連接而成。氣相色譜在前數十年間被廣泛用于葡萄果實成熟與葡萄酒釀造研究中，獲得大量數據[5-7]。然而，由于多種多糖及糖蛋白大分子含有相同的單糖，直接從單糖數據反推多糖數據只能建立在以往的經驗上，所獲信息并不準確。另一方面，此技術的前處理步驟繁瑣，需對多糖進行水解、衍生[8]，耗時耗力，不適用于大量樣本。

除分析單糖外，液相色譜也被用于分離鑒定葡萄酒中的多糖成分，如研究人員通過利用體積排阻等多種液相色譜法，成功分離出紅葡萄酒中的阿拉伯糖半乳糖蛋白、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖等多糖[9]，然而該技術耗時較長，分離效率低，且一些理化性質相近的分子不易分離[10]。薄層色譜是另一常用技術[11]，可根據不同分子在層析紙上的遷移速度分離一些結構相近（有無支鏈等）的分子（如寡聚糖），然而該技術在分離更復雜的大分子方面能力不足，近年來研究人員仍在不斷改良這項技術[12]。

1.2 紅外光譜分析

紅外光譜技術利用物質對不同波長紅外輻射的吸收特性，可有效區分具有不同官能團的多糖及糖蛋白大分子，在極短時間內對細胞壁樣本進行上百次掃描，形成光譜圖以作分析比較[13]。此技術靈敏度較高，不需對處

理好的細胞壁樣本進行水解衍生步驟，是近年來研究細胞壁多糖的關鍵方法之一。Kacuráková等[14]針對果膠以及半纖維素的不同多糖成分，確定了細胞壁各種多糖特征的光譜形狀和紅外光譜波數。紅外光譜產生的大量原始數據（不同波數的吸光度）可以運用多元數據分析方法來比較樣品間光譜的差異，定位造成差異的關鍵波數和與之對應的多糖大分子，近年來在葡萄與酵母細胞壁的研究中均有所應用[15-16]。然而，由于一些官能團（如羥基等）存在于結構相似的數種多糖（如果膠中的半乳糖醛酸聚糖和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖）中，因此紅外光譜的一些波數仍無法較精確的區分果膠、半纖維素級別以下的多糖分子，一般需要單糖數據進行共同分析[15]。

1.3 多糖抗體芯片分析技術

隨著免疫生物學的發展，精準識別各種多糖大分子結構的單克隆抗體被不斷研發合成（主要來自英國利茲大學、法國INRA以及美國喬治亞大學）[17-19]。這些抗體可精準區分相似結構的多糖，如高甲酯化果膠、低甲酯化果膠與無甲酯化果膠均有相應的單克隆抗體。多糖單克隆抗體的產生，結合植物組織切片的顯微鏡觀察，直觀而深入的展示了植物生長發育過程中的細胞結構變化。然而，多糖抗體造價昂貴，而且為了更清晰準確的觀察，在植物切片顯微鏡觀察中通常只能運用一到兩種抗體（結合不同顏色的指示劑），無法獲得更為完整的細胞壁信息。近年來，高通量多糖芯片技術的問世推動了多糖抗體的高效運用，此技術可同時將數百種用以比較的樣本（或處理）的細胞壁提取物高密度打印來制作芯片（2 cm×2 cm），極少的樣品量（5毫克細胞壁樣本）可制作上百張芯片，這些芯片可分別與數十種所需的單克隆抗體（用量微量）進行親和反應，最終形成大量親和度數據，用以構建熱圖或多元數據分析[20]。此技術自2007年誕生來，在煙草葉片細胞壁半纖維素的精細修飾、葡萄成熟過程中多糖大分子結構調控的品種間差異等相關領域研究中已經得到廣泛的應用[21-23]，Wood等[26]將多糖抗體技術與轉錄組數據相結合，提出該技術有利于輔助挖掘植物發育中關鍵結構標記物，拓展了其未來的應用。

2 細胞壁在葡萄與葡萄酒中的研究熱點

分析技術的發展也幫助我們在葡萄與葡萄酒相關的細胞壁研究不斷深入，從結構層面上逐步明晰了以往一些無法解釋的現象。以下從葡萄果實發育、葡萄酒釀造、葡萄酒品質與穩定三個方面簡要介紹近年來的細胞壁研究進展。

2.1 果實發育成熟中的細胞壁合成、修飾與降解

傳統的果實發育成熟研究通常關注糖、有機酸以及酚類化合物含量變化，而細胞壁對后續葡萄酒釀造的特殊性也使其成為重要的關注點之一。前期研究人員運用顯微鏡發現果肉細胞在成熟過程中完整性的變化，但并不能更深入獲得更多細胞壁的組分信息。因此更多的研究集中在運用氣相色譜分析果實細胞壁在葡萄成熟過程中各階段的單糖組分變化，嘗試挖掘除糖酸之外的結構標記物。一些分析發現，成熟過程中較為顯著的變化為半乳糖比例的降低[27]，這可能與細胞壁中半乳聚糖與I型阿拉伯半乳聚糖的降解相關，之后研究發現的β-半乳糖苷酶mRNA在轉色期的累積與成熟期的酶活性數據都進一步支持這一推論。成熟期內細胞壁果膠相關結構的變化也是一個顯著的特征，相關的數據不斷證實果膠的修飾降解是一個多酶參與精細調控的過程，目前已知的包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、果膠甲酯酶、果膠脫乙酰酶、果膠裂解酶、半乳糖醛酸聚糖酶等[27]。與其他水果相比，葡萄果皮中的果膠甲酯率在成熟過程中下降幅度相對較小（從58%降至48%）。 細胞壁其他成分的改變包括細胞壁蛋白含量的提高和纖維素、半纖維素含量的相對恒定[22]，而這些變化在后期的研究中被發現在不同葡萄品種間具有差異。如歐美雜交后代（Vitis vinifera×Vitis labrusca）顯示其細胞壁纖維素含量的降低與半纖維素中木葡聚糖的解構[28]，而歐亞種中‘霞多麗’品種成熟期木葡聚糖相關修飾/水解酶的表達也顯現出相似的表型結果[29]。另一項研究對比了歐亞種4個品種，發現‘慕合懷特’（Mourvedre），‘美樂’與‘赤霞珠’果肉中半乳聚糖含量、果膠甲酯化與乙酰化程度的降低，但這些變化都沒有在‘西拉’中出現[30]。多糖抗體芯片技術也在近期在葡萄成熟研究上有所應用，所獲結果不但印證了前期的單糖數據，并且更直觀快速的提供了有價值的新信息，如‘赤霞珠’成熟過程中細胞壁中識別高甲酯化果膠抗體與識別低甲酯化果膠抗體親和度的比值變化，而識別無支鏈木葡聚糖的抗體親和度降低，有支鏈木葡聚糖抗體親和度不變也更精確展現出半纖維素內部的精細修飾[22]，該研究人員還將‘赤霞珠’與鮮食葡萄‘克瑞森無核’進行從轉色期前至成熟階段的比較，兩品種顯示出差異較大的細胞壁修飾途徑。除品種差異外，同一品種也會受各種因素影響導致細胞壁結構狀態的變化，如對同一塊葡萄園內不同區域的成熟‘赤霞珠’進行細胞壁多糖的檢測后，發現其果膠的降解程度并非處于同一階段，盡管后期的酶浸漬在一定程度上降低了這些差異[31]。另一針對‘西拉’品種的果實脫水皺縮現象的細胞壁研究發現，相同糖度的皺縮果實與非皺縮果實間細胞壁各組分結構具有相當大的差異（未發表數據），這些差異也不可避免的將會對接下來的葡萄酒釀造造成影響。

2.2 釀造中葡萄細胞壁降解過程優化

在葡萄酒生產中，對葡萄果實的破碎可有效釋放出果肉中的糖和有機酸。然而，為達到高品質的葡萄酒，浸皮這一步驟是不可或缺的（特別是紅葡萄酒）。這是因為決定紅葡萄酒品質的物質（如花青素、單寧等）主要富集在細胞密集緊致，對機械破碎具有高耐受力的果皮中，因此對果皮細胞壁的有效降解是浸皮過程中的重中之重[32]。為提高浸皮效率，前數十年間研究人員對釀造工藝進行了多種方法的嘗試，包括對溫度的調控，如發酵前低溫浸漬、發酵后升溫等，添加微生物粗提物制備的果膠酶（混合酶制劑），以及嘗試運用一些輔助設備，如超聲波、脈沖電場等[33]。類似研究持續至今的原因是這些技術的不穩定性，甚至一些研究發現這些手段對某些品種的成酒品質影響微乎其微，或正面效應難以穩定，年份間、品種間、批次間的差異一直存在[34-35]。添加果膠酶雖然被廣泛應用于釀酒中，也被認為是相對最優的選擇，但產品間的差異，具體活性信息的缺失和可能存在的負面影響都依然存在。造成這一現象的關鍵因素是缺乏葡萄細胞壁的結構數據，以及其在釀造環境下的動態變化的觀測手段，導致我們對葡萄細胞壁的酶促打擊無法精準實施。如同果實成熟研究，前期研究人員對葡萄細胞壁在釀造中的變化相關研究也主要通過單糖分析手段[7]。由于品種間的差異，相關研究主要集中在一些酚類物質提取難度較高的品種，如西班牙研究人員對‘慕合懷特’的細胞壁結構以及各種工藝對其降解的影響進行了多年的研究[7,34,36]。針對其他品種的研究也一直在持續，然而，如同上文所言，傳統技術奠定了重要的數據基礎，但其缺陷也限制了我們進一步探究更準確的細胞壁結構信息。近年來，Gao等[37]首次運用高通量多糖抗體芯片的手段結合化學和酶促分餾技術，研究發酵過程中細胞壁成分的變化以及多糖的降解途徑。通過觀察各個餾分的多糖含量及構成，證實‘赤霞珠’果皮細胞壁含有豐富的果膠層，果膠的網絡結構由緊密結合

且高度甲酯化的半乳糖醛酸聚糖和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I型（RGI）組成，并推測出可能的支鏈結構。而浸漬過程中漿果中的果膠成分發生了明顯的去酯化和降解反應，最終皮渣以半纖維素結合RGI與糖蛋白等細胞壁組分為主。隨后該研究小組在此基礎上，設計不同的重組果膠酶組合，利用細胞壁分析技術跟蹤細胞壁結構的變化，結合前人關于細胞壁多糖組分間的鏈接關系，首次構建‘赤霞珠’果皮細胞壁的假想模型，提出‘赤霞珠’果皮細胞壁主要包含兩層構造，分別富含半纖維素和果膠，通過阿拉伯糖半乳糖蛋白（AGP）和延伸蛋白相互交聯。半纖維素內核被多層高度酯化的富含同型半乳糖醛酸與RGI的果膠所緊密包裹。而外圍較為疏松的果膠層主要含有低甲酯化的半乳糖醛酸聚糖和帶有支鏈的Ⅰ型鼠李糖半乳糖醛酸，支鏈多以阿拉伯聚糖為主，也連接一些細胞壁蛋白，比如AGP[39]。根據假想結構，研究人員指出果膠裂解酶可能在降解‘赤霞珠’果皮細胞壁、釋放酚類物質上起到核心的作用。鑒于品種間的細胞壁結構差異性以及各自追求的風格特點，未來仍需要對各主栽品種進行針對性的研究。

2.3 細胞壁多糖與葡萄酒品質

由于在葡萄酒澄清與穩定方面的潛在作用，細胞壁對多酚物質的吸附機制也逐漸引起研究人員的重視。研究發現，原花青素與碳水化合物的親和度由強到弱依次為果膠、木葡聚糖、淀粉、木質纖維素[39]，而它們之間的親和度也與雙方組分、構象相關。如單寧的聚合程度、果膠的甲酯化程度與親和度呈正相關。而葡萄成熟過程中，特別是后期果膠與單寧的親和度上升造成萃取量下降，則被認為是成熟后期果膠結構疏松，空隙增大造成的構象變化增加單寧的附著點[39]。因此，運用釀造后果膠疏松的皮渣來進行過量單寧的吸附，降低葡萄酒的澀感和不穩定因素（沉淀），被認為是一種可行的方法。另外，酒泥對葡萄酒酚類物質的吸附作用也被認為是酒泥中高含量的細胞壁糖蛋白、酵母細胞壁糖蛋白（主要為甘露糖蛋白Mannoprotein）與原花青素的高親和力相關。近期的研究運用高通量多糖抗體技術對酒泥的多糖組分進行了較為全面的分析，并對比了果膠酶對酒泥組分的影響[40]。

研究人員發現，在浸皮過程中，葡萄細胞壁在一系列果膠酶作用下的松動破裂除了提高了花青素、單寧等有益成分的萃取程度，也會向葡萄酒釋放出較小分子量的可溶的細胞壁多糖及糖蛋白分子，近年來這些分子被逐漸認為是影響葡萄酒品質的重要因素[41]。通過前期氣相色譜單糖分析，研究人員認為酒中含有的可溶性多糖成分主要包括半乳糖醛酸寡聚糖、RGI型與RGII型、阿拉伯聚糖、含阿拉伯糖支鏈的半乳聚糖、AGP等[9]。前期的研究工作指出，這些大分子可能對葡萄酒的生產與最終質量起到不同的影響，如AGP可降低葡萄酒的過濾難度[42]，來自酵母的甘露糖蛋白可降低白葡萄酒出現渾濁的可能[43]，RGI型與RGII型可延緩酒石酸結晶的形成[44]。然而，這些工作往往是針對某一種多糖，并且有些工作是在模擬酒溶液中進行，忽視了葡萄酒是一個更為復雜的體系，各種多糖大分子的存在，以及含量、相關作用可能給葡萄酒帶來更為綜合的影響。因此，將更為全面的可溶多糖數據與葡萄酒生產與品質相關聯能夠給我們提供更有價值的數據。近期，Gao等[37]嘗試對濃縮后的葡萄酒進行低溫乙醇沉淀與多糖成分提取，通過多糖抗體芯片技術得到‘赤霞珠’葡萄酒中較為全面的可溶性多糖組成數據。而Fangel等[45]進一步運用啤酒原酒本身作為多糖提取物，制作成多糖芯片并進行抗體檢測，較為清晰的區分出了釀造工藝對啤酒中多糖組分與含量的影響[45]，值得在葡萄酒多糖的研究中借鑒。

3 問題與展望

綜上所述，細胞壁是葡萄與葡萄酒學科中一個重要的研究領域。研究人員通過以往數十年的研究積累了大量的數據，初步明晰了細胞壁與葡萄果實生長發育、葡萄酒的生產與品質的提高具有很大的相關性。目前，世界葡萄酒產業已經逐步向精細化、個性化、定制化發展，如何在未來使葡萄酒的生產變得更為可控，從而突出品種優勢，彰顯產區特色，是我國葡萄酒產業發展的一個重要挑戰。而為應對這一挑戰，需要葡萄與葡萄酒各領域的研究人員共同就各產區提出更為針對性的關鍵問題。在葡萄細胞壁相關的研究上，目前有以下一些重要問題亟待解答：（1）如何針對不同葡萄品種間果實細胞壁存在的差異而設計更具針對性的釀造工藝，從而突出品種特色；（2）受氣候影響，我國不同產區的同一品種在同一成熟度下的果實細胞壁狀態是否存在差異，這種差異如何影響葡萄酒的生產與質量；（3）如何根據細胞壁結構數據設計工藝（如果膠酶的組成和比例），來平衡果實中有益物質的萃取程度和葡萄酒的最終品質；（4）葡萄酒中微生物（如釀酒酵母、野生酵母）是否能釋放細胞壁降解酶，這些酶如何影響葡萄果實細胞壁降解；（5）葡萄酒中可溶性多糖的組成、比例、互作與葡萄酒品質（香氣、口感、穩定等）間存在怎樣的關系。近年來檢測技術的飛速發展，為細胞壁精細結構的全面深入分析創造了條件，將會不斷拓寬我們對葡萄果實細胞壁合成、修飾、降解機制與葡萄酒生產中多糖動態過程監測的探索途徑，逐步明晰細胞壁及其內部成分在整個葡萄與葡萄酒生產過程中所擔任的角色與變化規律，為未來針對我國產區與主栽品種設計更為可控的栽培與釀造工藝提供關鍵數據。