聯(lián)合運用染色體核型分析與CNV檢測在超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒中的應(yīng)用價值*

張秀群 麥富巨 徐丹芬 趙卓姝 賴慧華 溫倩敏

胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常篩查多在妊娠11～13+6周進行，臨床上常見合并染色體異常的胎兒超聲異常種類包括胎兒心臟結(jié)構(gòu)畸形、胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形、胎兒泌尿生殖系統(tǒng)畸形、胎兒骨骼系統(tǒng)畸形、胎兒羊水量異常及胎兒軟指標異常等；臨床研究發(fā)現(xiàn)，有0.6%～1.9%的結(jié)構(gòu)異常胎兒存在心臟結(jié)構(gòu)異常，心臟畸形是導致新生兒死亡的重要因素之一，屬于人類先天性缺陷的首位；而經(jīng)胎兒超聲診斷為先天性心臟病的患兒中，染色體異常率高達40%以上[1]。為深入分析超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒的病理特征，提升其臨床診斷價值，本研究利用染色體核型分析法與CNV 檢測進行聯(lián)合檢測，就此展開針對性研究，并取得較為理想的臨床研究價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院于2019 年1-12 月收治的137 例超聲檢測顯示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦為觀察對象，孕婦年齡19～41 歲，平均（29.85±5.36）歲；孕周13～21 周，平均（20.49±3.72）周。（1）納入標準：均符合超聲診斷標準，超聲異常胎兒存在明顯的NT 增厚，無雙胎妊娠，孕婦均無妊娠異常。（2）排除標準：存在先天性疾病；存在認知、行為異常；存在表達能力障礙；存在婦科腫瘤、婦科炎癥。通過染色體核型分析與CNV 檢測展開聯(lián)合診斷。孕婦或家屬均對本次研究內(nèi)容知情同意，并簽署知情同意書，且該研究已經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 方法 （1）本次研究選擇的儀器為Illumina 公司的NextSeq-CN500 測序儀，試劑為貝瑞和康血漿游離DNA 提取試劑盒（磁珠法），測序反應(yīng)通用試劑盒，胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒（可逆末端終止測序法），美國THERMO CO2培養(yǎng)箱，北昂LABB M9 全自動染色體掃描儀及分析系統(tǒng)、美國CHANG Amnio 羊水細胞培養(yǎng)基，以色列 BIOAMF-2羊水細胞培養(yǎng)基。（2）CNV-seq 檢測：經(jīng)知情同意后，在超聲診斷儀的引導下，行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20 mL，收集的標本送湖南家輝遺傳病醫(yī)院進行檢測，使用北京貝瑞和康公司的科諾安試劑盒，按照標準流程操作進行DNA 提取→酶反應(yīng)→純化→文庫純化→文庫質(zhì)控→測序→生物信息分析。結(jié)果判讀參照人類基因組hg19 版本和DGV、DECIPHER、OMIM、UCSCS 及PubMed 等數(shù)據(jù)庫。結(jié)果判定根據(jù)相應(yīng)標準分為：良性CNVs，臨床意義不明確的CNVs（VOUS）和致病性 CNVs。對檢測到亞顯微結(jié)構(gòu)異常的致病性CNV 和可能致病的CNVs，建議胎兒父母行CNV-seq 檢測，以明確變異的遺傳性質(zhì)及相關(guān)臨床意義。（3）染色體核型分析：經(jīng)知情同意后，在超聲診斷儀的引導下，行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20 mL，按照本室常規(guī)方法進行細胞培養(yǎng)、染色體制備、G 顯帶及核型分析，必要時加做C 顯帶。每例計數(shù)30 個分裂相，分析6 個核型，嵌合體時計數(shù)50～100 個細胞，根據(jù)人類細胞遺傳學國際命名體制標準進行核型分析診斷。

1.3 觀察指標及判定標準 觀察染色體核型分析聯(lián)合CNV 檢測結(jié)果，統(tǒng)計診斷符合率，并分析染色體核型分析的核型結(jié)果與CNV-seq 結(jié)果。（1）染色體核型分析判定標準：染色體核型分析以中期染色體為基礎(chǔ)，根據(jù)染色體的長度、著絲粒的位置、長臂和短臂的長度以及衛(wèi)星的存在與否對染色體進行分析、比較、排序和編號；如發(fā)現(xiàn)染色體存在數(shù)目畸變（非整倍體、多倍體）或結(jié)構(gòu)畸變（缺失、重復(fù)、易位、倒位、環(huán)狀染色體和等臂染色體等）的情況為異常（陽性）；沒有以上所述的數(shù)目畸變或結(jié)構(gòu)畸變?yōu)檎＃幮裕＃?）CNV 檢測：檢測片段長度大于100 kb 的拷貝數(shù)復(fù)制、缺失情況，參照國際基因組CNV 多態(tài)性數(shù)據(jù)庫Decipher、UCSC Genome Browser、Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）、International Standards for Cytogenomic Arrays（ISCA）等以及相關(guān)文獻評估CNV 是否致病。①得到CNV 的結(jié)果，與序列數(shù)據(jù)庫進行比對，能比對到數(shù)據(jù)庫中，人群分別頻率n≥1%，說明CNV為人群中比較常見多態(tài)性即非致病性CNV。對于沒有比對到數(shù)據(jù)庫中的結(jié)果進行下一步。②與基因組變異數(shù)據(jù)庫（database of genomic variants）比對，數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)正常次數(shù)n≥3，表明CNV 為正常多態(tài)性即非致病性CNV。針對n＜3 的CNV 進行下一步。③與已知微缺失微重復(fù)綜合征比對，能比對到綜合征的CNV 既致病性CNV。其他進行下一步。④進一步看CNV 涉及區(qū)域中是否包含重要功能基因，不包含基因或重要功能性基因的即為非致病性CNV；包含重要功能性基因進行下一步。⑤在網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫和文獻中進行搜索，CNV 與疾病案例存在片段相同或包含該片段，且臨床表型相似的CNV 即致病性CNV；假如沒有重疊區(qū)域或有重疊但表型不一致，即為不明臨床意義CNV。（3）聯(lián)合檢測判定標準：染色體核型分析與CNV 檢測任一結(jié)果顯示陽性即判定為異常（陽性）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各種檢測方式的異常檢出率比較 本次研究發(fā)現(xiàn)，在137 例經(jīng)超聲檢測顯示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦中，染色體核型分析對異常胎兒的檢出率低于CNV檢測以及聯(lián)合檢測。聯(lián)合檢測與染色體核型分析的檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CNV檢測與染色體核型分析及聯(lián)合檢測的檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各種檢測方式的異常檢出率比較

2.2 胎兒染色體核型正常而CNV-seq 異常的結(jié)果 染色體核型結(jié)果顯示正常的胎兒中，檢測出有15 例CNV-seq 結(jié)果為異常，檢出率為10.95%（15/137），其中已知致病性的CNVs 有8 例，其余7 例為VOUS。8 例致病性的CNVs 中，有4 例的CNV 均為16 號染色體短臂微缺失，其中3 例是16p11.2 微缺失，1 例缺失是16p12.2；2 例為X 染色體短臂微重復(fù)；1 例為19 號染色體短臂微缺失；1 例為X 染色體單體。7 例CNV-seq 結(jié)果為VOUS 的胎兒中，有3 例為22 號染色體長臂微缺失，1 例為22 染色體長臂微重復(fù)；1 例為9 號染色體短臂微重復(fù)；1 例為14 號染色體長臂微重復(fù)；1 例為15 號染色體長臂微缺失。見表2、3。

表2 染色體核型正常的8例致病性CNVs的B超情況與CNV-seq結(jié)果

表3 染色體核型正常的7例VOUS的B超情況與CNV-seq結(jié)果

3 討論

臨床研究統(tǒng)計我國新生兒出生畸形率約為3%，由此可見，我國具有較高的新生兒畸形率，因此開展妊娠期胎兒診斷在提升人口素質(zhì)，降低新生兒畸形率、緩解社會負擔方面具有十分重要的意義[2]。

隨著臨床超聲儀器及檢查技術(shù)的高速發(fā)展，針對早期胚胎的檢出水平得到明顯提升；通過超聲系統(tǒng)篩查能夠有效檢出胎兒形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，同時還能夠經(jīng)由超聲軟指標觀察胎兒身體狀態(tài)。微小異常指超聲下發(fā)現(xiàn)的胎兒解剖結(jié)構(gòu)非特異微小變化，多屬于正常變異，即軟指標；與結(jié)構(gòu)畸形相比，軟指標預(yù)后良好，單獨或同時出現(xiàn)多個微小異常在高危妊娠可能增加染色體畸形的風險，且多數(shù)微小異常隨孕周增加而逐漸好轉(zhuǎn)或消失[4]。胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常多見于頸項透明層增厚，即NT 增厚，通常在妊娠11～13+6周時，胎兒頸背部會出現(xiàn)一層無回聲帶，為皮下組織內(nèi)液體的積聚，在孕11 周時超過1.9 mm、孕12 周時超過2.1 mm、孕13 周時超過2.2 mm、孕11～13+6周時超過2.5 mm 均可判定為異常情況。針對NT 增厚與染色體異常，臨床研究發(fā)現(xiàn)在孕早期所有的染色體異常均與NT 增厚有關(guān)，頸項透明層增厚越明顯，發(fā)生胎兒結(jié)構(gòu)異常與染色體異常的概率越大，同時NT 增厚與胎兒先天性心臟病高度相關(guān)。因此超聲診斷能夠通過檢查心臟位置異常、心房和心室的結(jié)構(gòu)異常、大血管的發(fā)育異常確定胎兒結(jié)構(gòu)異常情況；同時通過判斷間隔、房室瓣主動脈的發(fā)育結(jié)構(gòu)，確定其畸形情況[3]。結(jié)合上述內(nèi)容可知，胎兒的NT 超聲檢查在孕早期對不同發(fā)育異常情況均有一定的診斷價值，檢出率超過1/3[4]。

染色體核型分析作為一種經(jīng)典遺傳學檢測方式，指將待測細胞的染色體依照該生物固有的染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，按照一定的規(guī)定，人為的對其進行配對、編號和分組，并進行形態(tài)分析的過程[5]。經(jīng)血培養(yǎng)、制片、烤片、染色、掃片、閱片、審核及復(fù)審等過程，能夠有效檢出胎兒結(jié)構(gòu)異常情況，且具有較高的準確率[6-7]。但其操作流程較為復(fù)雜、分辨率較低，對于醫(yī)師的技術(shù)要求高，在檢測中細胞生長狀態(tài)及顯帶水平均是影響實驗結(jié)果的主要因素。雖然在分子遺傳學技術(shù)發(fā)展下，熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PCR 技術(shù)得到普及應(yīng)用，但與染色體核型分析一樣存在缺陷，即在檢測來源未知染色體片段與染色體微缺失微重復(fù)鑒別時無法準確識別[8-9]。近年來，臨床醫(yī)療水平不斷提升，高通量測序技術(shù)高速發(fā)展，進一步推動了分子技術(shù)在遺傳病檢測、腫瘤檢測、產(chǎn)前篩查、微生物病原體等方面的積極應(yīng)用[10]；而CNV-seq 作為一種以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測方式，在檢測中不需要進行細胞培養(yǎng)，且對于探針種類選擇、通量等無限制，具備通量高、成本低、操作簡單、范圍廣泛的優(yōu)勢[11]。尤其在2019 年4 月所發(fā)布的《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識》中指出，通過CNV-seq 檢測有助于對染色體核型分析中存在的不足進行彌補，因此可用于一線產(chǎn)前診斷[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過染色體核型分析與CNV 檢測，能夠有效檢出胎兒結(jié)構(gòu)異常，辨識胎兒神經(jīng)畸形狀況，便于區(qū)分高危妊娠增加染色體畸形的風險，提示胎兒染色體及心血管方面的異常情況，以便于臨床上及時采取有效的治療措施[15-16]。染色體核型分析在137 例經(jīng)超聲檢測結(jié)構(gòu)異常胎兒中的異常檢出率較CNV 檢測與聯(lián)合檢測異常檢出率更低，且CNV 檢測胎兒異常檢出率低于聯(lián)合檢測異常檢出率。分析原因可知，G 顯帶染色體核型分析方式雖然能夠?qū)φ兹旧w數(shù)目與明顯結(jié)構(gòu)異常情況快速檢出，但受制于分辨率較低的因素影響，對于片段長度在5 Mb 以下的結(jié)構(gòu)異常情況難以準確檢出[11，17]。而聯(lián)合CNV-seq 則能克服現(xiàn)有染色體診斷技術(shù)中存在的缺陷，充分發(fā)揮協(xié)同作用，可以快速、準確檢測出＞100 kb 以上的結(jié)構(gòu)異常片段，對于染色體微缺失或微重復(fù)診斷效果理想[18]；因此染色體核型分析結(jié)合CNV-seq 檢測的應(yīng)用有助于為臨床診斷提供更詳細、準確信息，繼而為遺傳咨詢及生育指導提供可靠依據(jù)。

綜上所述，染色體核型分析與CNV 檢測在超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒中具有較高的臨床應(yīng)用價值，高危妊娠孕婦可通過染色體核型分析聯(lián)合CNV 檢測盡早篩查胎兒結(jié)構(gòu)異常情況，從而提升臨床控制效果，提升診斷準確率。