硼硅酸鹽生物玻璃浸提液對大鼠成骨細胞增殖分化的影響及其機制

何曉輝 陳武生 楊珩欽 詹建勇 莊一凡 莊鑫泓 羅輝 秦育濱

骨質疏松癥是由于多種原因導致的骨密度和骨質量下降，骨微結構破壞，造成骨脆性增加，從而容易發生骨折的全身性骨病。成骨細胞主要由內外骨膜和骨髓中基質內的間充質始祖細胞分化而來，是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化[1]。因此，對成骨細胞進行保護在骨質疏松癥的預防及治療中具有非常重要的作用。硼硅酸鹽生物玻璃作為新型的生物材料，不僅能夠通過轉化為羥基磷灰石來促進骨修復，還能通過硼酸鹽誘導骨再生的活性來促進骨修復[2]。目前關于硼硅酸鹽生物玻璃對成骨細胞增殖分化影響的研究報道很少見。基于此，本研究將通過探討硼硅酸鹽生物玻璃浸提液對大鼠成骨細胞的保護作用及其相關機制，為硼硅酸鹽生物玻璃防治骨質疏松癥及促進骨修復提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 ROS1728 大鼠成骨細胞由上海佰曄生物科技中心提供，貨號 :SX-C1200。

1.1.2 儀器 CO2培養箱由德國美墨爾特公司生產；超凈工作臺由萊特（南通）科學儀器有限公司生產；凝膠成像系統由杭州朗基科學儀器有限公司生產；倒置熒光顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產；實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測系統由美國Bio-Rad 公司生產。

1.1.3 試劑 培養基由上海佰曄生物科技中心生產；CCK-8 試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒、PCR 試劑盒及Western-blot 試劑盒由英國Abcam 公司生產。

1.1.4 硼硅酸鹽生物玻璃浸提液 將硼硅酸鹽生物玻璃材料的顆粒與高糖DMEM 培養基混合，比例為每3cm2硼硅酸鹽生物玻璃顆粒加入1ml DMEM培養基，37℃條件下孵育浸提24h，收集浸提液、0.22μm 過濾除菌后4℃放置備用。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 實驗 成骨細胞按3×103個/100μl 接種于96 孔培養板，培養箱中培養24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl 繼續培養，以不加浸提液的完全培養基為對照組，培養成骨細胞24、48、72h，每孔加10μl CCK-8 溶液，置于CO2細胞培養箱中孵育2h 后，用酶標儀測定450nm吸光度值。

1.2.2 鈣鹽沉積量檢測 成骨細胞按1×105個/孔接種于6 孔板中，細胞培養箱中培養24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl 繼續培養，以不加浸提液的完全培養基為對照組，培養成骨細胞12、16d。取出培養板去除培養液，用PBS 洗一遍。每孔加入100μl 的樣品裂解液。用槍吹打數下，使樣品裂解液和細胞充分接觸。充分裂解后，4℃，14 000g 離心5min，取上清，冰上放置待測。酶標儀測量570nm 處的吸光度，制作標準曲線，計算樣品的鈣濃度。

1.2.3 堿性磷酸酶染色 成骨細胞按1×105個/孔接種于6 孔板中，細胞培養箱中培養24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl 繼續培養，以不加浸提液的完全培養基為對照組，培養成骨細胞6、9、12d。去除培養基，用PBS 清洗一次，然后用120μl 裂解液裂解細胞，收集細胞裂解液，4℃，14 000g 離心5min，取上清，按照試劑盒步驟進行操作。加入標準品和樣品（50μl），37℃孵育20min 后，每孔加入100μl 反應終止液終止反應。使用酶標儀在405nm 測定吸光度。

1.2.4 RT-PCR 法 成骨細胞按1×105個/孔接種于6 孔板中，細胞培養箱中培養24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl繼續培養，以不加浸提液的完全培養基為對照組，培養成骨細胞9d。提取總RNA，行RT-PCR 法檢測Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 的表達水平。引物序列表見表1。

表1 引物序列表

1.2.5 Western-blot 法 成骨細胞按1×105個/孔接種于6 孔板中，細胞培養箱培養24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl 繼續培養，以不加浸提液的完全培養基為對照組，培養成骨細胞9d。提取總蛋白，測定PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白的表達。一抗：PI3K[Cell Signaling Technology（CST），3358，1∶1000]、p-AKT（CST，4058，1∶1000）、RUNX2（CST，12556，1∶1000）、beta-actin（CST，16275，1∶1000）。二抗：鼠抗（CST，7076，1∶1000），兔抗（CST，7074，1∶1000）。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度浸提液對成骨細胞增殖的影響培養24、48、72h 時，高劑量組與低劑量組成骨細胞增殖能力均明顯高于對照組（P＜0.05），高劑量組成骨細胞增殖能力均明顯低于低劑量組（P＜0.05），見表2。

表2 CCK-8 實驗檢測不同濃度浸提液對成骨細胞增殖的影響（，n=6）

表2 CCK-8 實驗檢測不同濃度浸提液對成骨細胞增殖的影響（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

2.2 不同濃度浸提液對成骨細胞活力的影響培養6、9、12d 時，高劑量組與低劑量組成骨細胞活力均明顯高于對照組（P＜0.05）；培養6、9d 時，高劑量組與低劑量組成骨細胞活力比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；培養12d 時，高劑量組成骨細胞活力明顯高于低劑量組（P＜0.05），見表3。

表3 堿性磷酸酶染色檢測不同濃度浸提液對成骨細胞活力的影響（，U/mg，n=6）

表3 堿性磷酸酶染色檢測不同濃度浸提液對成骨細胞活力的影響（，U/mg，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

2.3 不同濃度浸提液對成骨細胞鈣鹽沉積量的影響培養12、16d 時，高劑量組與低劑量組成骨細胞鈣鹽沉積量均明顯高于對照組（P＜0.05），高劑量組成骨細胞鈣鹽沉積量均明顯高于低劑量組（P＜0.05），見表4。

2.4 不同濃度浸提液對成骨細胞基因mRNA 表達的影響高劑量組與低劑量組成骨細胞Wnt3a、β-catenin、BMP2 mRNA 表達水平均明顯高于對照組（P＜0.05）；高劑量組與低劑量組成骨細胞Wnt3a mRNA 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），高劑量組與低劑量組成骨細胞β-catenin、BMP2 mRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表4 不同濃度浸提液對成骨細胞鈣鹽沉積量的影響（，μg/ml，n=6）

表4 不同濃度浸提液對成骨細胞鈣鹽沉積量的影響（，μg/ml，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

表5 RT-PCR法檢測不同濃度浸提液對Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 表達的影響（，n=6）

表5 RT-PCR法檢測不同濃度浸提液對Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 表達的影響（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

2.5 不同濃度浸提液對成骨細胞蛋白表達的影響高劑量組與低劑量組的成骨細胞PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表達水平均明顯高于對照組（P＜0.05）；高劑量組的成骨細胞PI3K、RUNX2蛋白表達水平均明顯高于低劑量組（P＜0.05），高劑量組與低劑量組的成骨細胞p-AKT、beta-actin 蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 Western-blot 法檢測不同濃度浸提液對成骨細胞PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表達的影響

3 討論

隨著社會老齡化加劇，骨質疏松癥的發病率已躍居世界各種常見疾病的第7 位，被公認為嚴重的社會公共健康問題。2018 年中國骨質疏松流行病學調查結果顯示：我國50 歲以上人群骨質疏松癥患病率為19.2%，65 歲以上人群骨質疏松癥患病率達到32.0%[3]。因此，對骨質疏松癥進行防治很重要。

生物材料被廣泛應用于骨科疾病的臨床治療中，較好的生物相容性及能夠對成骨細胞增殖分化起到誘導作用，是理想生物材料需要具備的特點[4]。硼硅酸鹽生物玻璃是近年來興起的一種新型生物材料，具有較好的生物活性和降解性能，能夠為骨組織的再生提供生長所需要的營養物質、細胞因子及空間[5，6]。有研究顯示，硼硅酸鹽生物玻璃能夠通過相關成骨信號通路誘導成骨細胞發生增殖[7]。為了進一步明確硼硅酸鹽生物玻璃影響成骨細胞增殖分化的機制，我們通過研究發現，高劑量組與低劑量組的成骨細胞增殖能力、活力及鈣鹽沉積量均明顯高于對照組，說明硼硅酸鹽生物玻璃浸提液能夠明顯促進成骨細胞的增殖與分化，利于骨組織的再生與愈合。

Wnt 信號通路由一系列相互作用的分子組成，這些分子的相互作用及功能可通過調節成骨細胞的分化、增殖及功能而間接影響骨形成，若抑制Wnt信號通路轉導可使成骨細胞分化進程受阻，從而抑制骨形成[8～10]；若誘導Wnt 家族成員表達則可使成骨細胞特異性基因表達增加，促進骨形成[11]。研究表明PI3K/AKT 信號通路在骨生長調節中通過調節堿性磷酸酶、骨鈣蛋白和p-AKT 的表達發揮重要作用[12～15]。本研究中，與對照組比較，高劑量組與低劑量組的成骨細胞Wnt3a mRNA及PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表達水平均明顯增高，說明硼硅酸鹽生物玻璃浸提液能夠上調Wnt 信號通路及PI3K/AKT 信號通路，對成骨細胞有保護作用。

綜上所述，硼硅酸鹽生物玻璃浸提液能夠促進大鼠成骨細胞的增殖分化，提高鈣鹽沉積量，其機制可能為通過激活Wnt 及PI3K/AK 信號通路而發揮作用。但是沒有確定最優濃度，還需要進一步深入研究。