快速現場評價技術在肺隱球菌病診斷中的實時性和準確性

葉玲 洪苓苓

肺隱球菌病（Pulmonary cryptococosis，PC）是一種由隱球菌感染引起的急性或亞急性肺部真菌病，隱球菌主要經呼吸道進入體內，肺是隱球菌感染的首發部位，中樞神經系統最易受累，是一種常見的機會感染性疾病，好發于免疫功能低下者，但在免疫力正常的患者中，若合并相關易感因素者也可出現[1，2]。研究報道顯示，肺隱球菌病患者的臨床表現可以無癥狀，也可以表現為致死性的感染[3]。而在影像學上，PC 可因免疫功能的差異出現各種影像學表現，以肺部單發或多發的周圍型的結節團塊及局限的肺炎樣病灶最為多見，約占66%，其次還可表現為彌漫的、播散的肺炎樣浸潤和實變，可形成空洞和暈征，亦可表現為網格狀浸潤、肺門縱隔淋巴結腫大、胸腔積液、彌漫性粟粒影及磨玻璃樣滲出等[4]。

隱球菌抗原檢測是診斷PC 的一種無創、快速、有效的實驗方法，其次為病原學檢查，可常規行支氣管鏡下毛刷及BALF 直接鏡檢或培養，但陽性率不高，因此，組織病理學檢查是確診肺隱球菌病的“金標準”，其病理改變為典型肉芽腫性病變（非干酪樣），通過特殊染色（墨汁染色、PAS 染色、六胺銀染色等）可明顯提高隱球菌的檢出率。

快速現場評價（rapid on-site evaluation，ROSE）是目前呼吸介入病學中不可缺少的一部分，它可以在支氣管鏡檢查、肺穿刺等介入操作過程中由細胞或微生物病理學專業人員對穿刺標本進行現場制片和染色并快速評價，向操作者反饋穿刺是否成功，減少不必要的穿刺，提供初步診斷[5，6]。ROSE技術包括快速現場細胞學評價（C-ROSE）和快速現場微生物學評價（M-ROSE），臨床上C-ROSE 應用范圍更廣，M-ROSE 則更多地應用于真菌感染疾病的診斷，由于微生物大多需要特殊染色，臨床上確診時間被拉長，而M-ROSE 則通過其獨有的實時性及高準確性在肺部特殊感染的診斷中具有優勢，本研究通過對比我院近2 年肺隱球菌病患者的診治過程，探討M-ROSE 聯合肺活檢對疑診肺隱球菌病的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料回顧性分析我院近2 年收治的經病理確診為肺隱球菌病的患者資料。納入標準：①術前已行胸部CT 平掃+增強顯示肺部單發或多發的結節團塊影或肺炎樣病灶，但經正規抗感染治療無效；②綜合分析患者的病史、輔助檢查結果后高度懷疑肺隱球菌病；③術前完善檢查，排除肺活檢相關禁忌證；④術前告知患者及家屬操作過程及相關風險并簽署知情同意書。排除標準：①存在凝血功能障礙、嚴重心、肺功能衰竭等手術禁忌證；②不能獲取完整臨床資料者。共收集4 例肺隱球菌病患者，其中男1 例，女3 例，年齡26～53 歲，平均42.2歲。其中，慢性乙型肝炎1 例，精神分裂癥1 例，系統性紅斑狼瘡1 例，無基礎疾病1 例。肺部影像學多表現為多發結節或肺炎樣病變（見圖1）。所有病例結核菌素試驗、結核感染T 細胞檢測均陰性，隱球菌莢膜抗原陽性3 例，陰性1 例，所有患者均已行M-ROSE 且最終均經病理確診。

1.2 研究方法

1.2.1 CT 引導下肺穿刺過程 術前常規鎮靜、鎮痛，監測生命體征，閱片評估，定位后CT 引導，18G 半自動活檢針、同軸引導活檢針穿刺切割獲取病變組織，呼吸科醫師現場進行制片、染色及快速評價，隨后將幾乎無損失的剩余組織固定后送檢病理，穿刺結束后記錄ROSE 判讀結果所需時間。

1.2.2 M-ROSE 過程 取材后由經正規培訓后的呼吸科醫師現場制片：取材后組織滾片，迪夫快速染色（A 液20s，B 液30s），顯微鏡下根據細胞學特征行快速現場評估，若M-ROSE 結果為陽性則繼續原位取材，若M-ROSE 結果為陰性則調整后再次取材，記錄當時M-ROSE 陽性結果的判讀時間。現場閱片結果判定標本滿意，記錄ROSE 診斷結果及具體時間，結束操作（見圖2）。

1.3 診斷結果的判讀以CT 引導下肺穿刺術后送檢的組織標本所獲得明確的病理結果為最終診斷，本研究中病例標本的病理PAS 染色后均可見隱球菌孢子，可以明確診斷肺隱球菌病（見圖3）。

圖1 4 例肺隱球菌病患者的胸部CT 表現，其中有空洞、結節、實變影等表現

圖2 肺隱球菌病的ROSE 表現（×200，箭頭所示為隱球菌孢子）

圖3 肺隱球菌病的病理表現（×400，箭頭所示為隱球菌孢子）

1.4 穿刺標本合格性判斷若某一標本在鏡下可見明顯特殊細胞，則認為該穿刺標本合格；若患者的組織學標本見大量紅細胞、壞死細胞、呼吸道粘膜細胞，則認為該穿刺標本不合格。隱球菌快速迪夫染色（Diff-quik stain）后鏡下可見菌體，圓形或橢圓形，直徑5～25μm，鏡下似空泡，有厚壁莢膜，莢膜可比菌體大1～3 倍，亦可見芽生孢子[7]。菌體和孢子多存在于肉芽腫和巨噬細胞中（見圖2）。

1.5 統計學方法以SPSS 22.0 統計軟件進行統計分析，計量資料比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 診斷準確性所有患者肺穿刺術后的病理學結果即為患者的最終診斷，現場M-ROSE 的報告與病理結果的符合率為100%，ROSE 對肺隱球菌病的診斷敏感度為100%。目前暫無陰性結果。

2.2 診斷實時性4 例肺隱球菌病患者ROSE 口頭判讀時間為5min、9min、6min、9min，平均時間為7.25min，出具報告的時間為30min、50min、33min、58min，平均為42.75min，病理結果最終報告的時間為取材后78h、72h、72h、88h，除去外送病例的病理結果時間，平均病理報告時間需要77.33h，兩組之間對比差異有統計學意義（t=-14.283，P＜0.05）。

2.3 并發癥的比較CT 引導下肺活檢術已基本成熟，常見的并發癥多為咯血、氣胸、縱隔氣腫、心律失常、低血壓、發熱等，本研究的患者均無明顯并發癥。

3 討論

近年來，由于抗生素、激素、免疫抑制劑、細胞毒性藥物的大量使用導致機體免疫功能缺陷，所以PC 患者已逐年增加，但也有報道稱 50% 的 PC 患者可以為免疫功能正常的人群，且臨床表現輕微，也是導致臨床上PC 診斷困難的重要因素[8]。病理結果已成為PC 的確診依據，而在早期或者高度疑似病例，隱球菌抗原檢測（膠體金免疫層析法）可作為篩查，其中膠體金免疫層析法比乳膠凝集法和酶聯免疫法具有更高的準確性，其敏感性和特異性可達91.67%和99.61%，且在室溫下穩定，10min 即可出結果[9]，本研究中ROSE 口頭報告平均時間為7.25min，且與病理結果的符合率達100%，由于樣本量較少，二者之間差異是否具有統計學意義尚需進一步研究。

隨著呼吸介入及快速染色技術的崛起，快速現場評價技術的價值與優勢越來越突出，已經逐漸滲透到臨床中并廣受歡迎，尤其是對介入呼吸病學的診斷方面[10,11]。ROSE 主要包括制片、染色和閱片三個步驟，研究表明，通過短期學習，普通臨床、醫技工作者都可掌握ROSE 的快速制片染色方法，但ROSE 的閱片判讀才是現場評估的重點。在國外，曾有報道由生物醫學科學家幫助判讀ROSE 結果，但因其成本較高而無法推廣，目前處于嘗試階段[12]。2014 年Chest 雜志發表的一項研究表明，肺科醫師經過3 個月的細胞病理學知識培訓后，進行ROSE 判讀，準確率達80%，與細胞病理學家92%的準確率相比，未見統計學差異[13]。在國內，由馮靖教授及其團隊對呼吸介入ROSE 的開展和推廣起到極其重要的作用，其中的成人C-ROSE 與術后病理診斷符合率近100%，M-ROSE 中結核病與病理診斷符合率約70%，真菌感染臨床符合率超過90%[14～16]。本研究結果表明ROSE 報告及最終病理結果的一致率達到了100%，而且ROSE 可明顯縮短肺隱球菌病的診斷時間，能盡早開始抗真菌治療，減輕患者的經濟負擔，值得臨床推廣。

目前，對于M-ROSE 可進行的染色方式有[17]：①迪夫快速染色：它是在瑞氏染色基礎上加以改良所形成的一種極快速染色方式，耗時僅50s，多數情況下1min 內就可以在顯微鏡下觀察。這種染色通常用于絕大多數C-ROSE 與M-ROSE，是ROSE 最常用的染色方式，也是現階段WHO 唯一推薦的標準ROSE 染色方法[18]。②極快速改良乳酸染色，主要應用于各類真菌。③快速支原體 DNA 霍氏熒光染色，主要應用于支原體感染。④快速金-羅耐酸菌熒光染色，主要應用于抗酸菌如結核分枝桿菌、奴卡菌、軍團菌。⑤試劑盒化快速革蘭染色，主要應用于球菌和桿菌。

M-ROSE 的優勢不僅體現在微生物形態學方面，還可以提供明確的細胞學背景。研究表明，中性粒細胞和巨噬細胞是機體對抗肺部細菌感染的主要防御機制，因此，中性粒細胞、巨噬細胞或淋巴細胞吞噬細菌現象對感染性疾病的微生物病原有明確的提示意義[16]。采用 BALF 快速制片結合M-ROSE 在中性粒細胞和肺泡巨噬細胞吞噬細菌方面可以獲得較高的陽性率，這也提示了M-ROSE在呼吸介入病學應用中的重要地位[13]。

綜上所述，本研究通過總結分析4 例肺隱球菌患者的診斷和治療經過，表明ROSE 技術在肺隱球菌病理診斷中具有快速準確的優勢，優于隱球菌莢膜抗原的檢測，臨床意義重大。本研究仍存在不足，由于我科ROSE 技術開展尚早，病例樣本量不大，需繼續收集符合納入標準的樣本進一步證明ROSE快速診斷的優勢，此外，由于醫院條件及設備的限制，現場制片及染色之間存在一定的時間浪費，導致ROSE 報告時間延長，有望進一步縮短報告出具時間，上述兩點不足之處需要更多的實踐進一步探討及改進。