miR-335-5p和轉錄因子ATF2在宮頸癌中的表達關系研究

冉 偉， 廖 萍， 劉興蘭， 馬曉潔

(川北醫學院附屬醫院， 四川 南充 637000)

宮頸癌是婦科常見的生殖系統惡性腫瘤，我國每年的宮頸癌新增病例遠高于發達國家，近年來的發病狀況趨于年輕化[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要發病原因，尤其是HPV16和HPV18在誘發宮頸癌中扮演重要角色，但婚育情況、遺傳因素等也可能會誘發宮頸癌[2]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是長度為22～24nt的非編碼單鏈RNA，其在多種腫瘤疾病中起到抑癌或致癌的作用，參與腫瘤細胞的增殖、轉移、侵襲和凋亡等[3]。研究發現微小RNA-335-5p(micro RNA-335-5p，miR-335-5p)在多種腫瘤中具有不同的作用，在乳腺癌中表達呈下降趨勢[4]，而在非小細胞肺癌中表達上調[5]，但其在宮頸癌中的表達及作用鮮少有報道。激活轉錄因子2(activating transcription factor 2，ATF2)是ATF/CREB家族的成員，具有堿性-亮氨酸拉鏈結構[6]。ATF2能被多種細胞途徑應激和細胞因子刺激所激活，如病毒感染、DNA損傷和細胞凋亡等。研究顯示，ATF2可參與腫瘤的發生發展，在胰腺癌細胞系中表達上調，抑制細胞周期G1/S，減緩細胞的增殖，但其對宮頸癌的影響方式尚未明確[7]。本研究將通過檢測miR-335-5p和ATF2在宮頸癌中的表達情況，分析二者之間的關系及對宮頸癌的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選取2017年8月至2019年10月在本院進行手術治療的72例宮頸癌患者作為實驗組，年齡33～75歲，平均年齡(48.32±11.53)歲；選擇同期進行手術治療的65例子宮肌瘤患者作為對照組，年齡35～74歲，平均年齡(46.86±10.37)歲，兩組患者的一般資料比較無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：①經病理檢查確診；②首次進行手術治療的患者；③術前3個月未進行放療或化療者；④患者及家屬知曉本研究內容，均簽署知情同意書。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②合并患有其他系統疾病者；③自身免疫疾病者。本研究經川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準。

1.2主要試劑與儀器:RNA提取試劑盒(貨號：12183020)、反轉錄試劑盒(貨號：4368813)均購自于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；qRT-PCR試劑盒(貨號：FP304-01)購自北京天根生化有限公司；ATF2兔抗人多克隆抗體(貨號：CM-07094)、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP2)兔抗人多克隆抗體(貨號：CM-0348)均購自美國Labvision生物公司。Bio-Rad PCR儀(型號：S1000)購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.3方 法

1.3.1樣品采集:收集手術切除的宮頸癌癌組織和子宮肌瘤患者的宮頸組織，將樣本分為兩部分，一部分經石蠟包埋，制備成石蠟切片，另一部分置于-80℃冰箱保存以備后續使用。

1.3.2實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)法測定miR-335-5p、ATF2 mRNA及MMP2 mRNA的表達量:取出保存的樣本，提取總RNA：對樣本超聲勻漿，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，檢測RNA純度并用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整度；逆轉錄反應：將所得RNA按照反轉錄試劑盒說明操作，反轉錄為cDNA，產物置于-20℃冰箱保存備用。實時熒光定量PCR：反應體系20μL，10 μL 2×SYBR Mix，上下游引物各1 μL，cDNA模板2μL，H2O 6μL，每個樣品做3個重復，反應條件為95℃反應45s，95℃反應10 s、60℃反應30 s，35個循環，72℃延伸10 min，在qPCR儀上進行反應。miR-335-5p以U6為內參；ATF2及MMP2均以β-actin為內參。引物均由寶日醫生物技術(北京)有限公司合成。使用ΔΔCt法對結果進行相對定量分析，根據各樣本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-335-5p、ATF2 mRNA及MMP2 mRNA的相對表達量。miR-335-5p、ATF2、MMP2及內參基因β-actin、U6的引物序列見表1。

表1 miR-335-5p ATF2 MMP2及內參基因β-actin U6的引物序列

1.3.3免疫組化檢測宮頸癌組織中ATF2蛋白和MMP2蛋白的表達情況:將石蠟切片脫蠟后，分別在梯度乙醇中孵育2～3min，經蒸餾水漂洗后在3%H2O2中常溫孵育15min，抗原熱修復，在檸檬酸鹽緩沖液中加熱5min，經PBS溶液清洗，加入山羊血清孵育20min，滴加適當比例稀釋的一抗濕盒中孵育過夜，PBS清洗3遍，加入對應的二抗孵育30min，PBS溶液清洗，DBA顯色液進行顯色反應，染色成功后，蒸餾水沖洗，在蘇木素中復染1min，蒸餾水沖洗后置于1%鹽酸中10s，再用蒸餾水沖洗，最后分別置于梯度乙醇中脫水2-3min，經透明處理后，封片鏡檢。ATF2定位于細胞核，陽性表達細胞核有棕黃色顆粒，陰性表達則細胞不染色；MMP2定位于細胞漿，陽性表達細胞漿呈棕黃色，陰性表達則細胞不染色。

2 結 果

2.1qRT-PCR檢測兩組miR-335-5p、ATF2 mRNA及MMP2 mRNA的表達情況:實驗組miR-335-5p、ATF2 mRNA及MMP2 mRNA的表達量均明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組miR-335-5p ATF2 mRNA及MMP2 mRNA水平比較

2.2兩組ATF2蛋白和MMP2蛋白的表達情況:實驗組ATF2蛋白的陽性表達率為56.94%，明顯高于對照組43.06%(P<0.05)；MMP2蛋白的陽性表達率為45.83%，明顯高于對照組6.15%(P<0.05)。見表3。

表3 宮頸癌組織中ATF2和MMP2蛋白陽性表達率 n(%)

2.3宮頸癌患者miR-335-5p、ATF2及MMP2表達與臨床病理特征的關系:根據實驗組miR-335-5p表達水平的中位值將其分為兩組，其中高表達組共37例，低表達共35例。宮頸癌患者癌組織中miR-335-5p、ATF2及MMP2的表達水平與年齡、腫瘤直徑無關(P>0.05)；miR-335-5p、ATF2及MMP2的表達水平與FIGO分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表4。

表4 宮頸癌患者miR-335-5p ATF2及MMP2表達與臨床病理特征的關系n(%)

2.4影響宮頸癌的多因素分析:將宮頸癌是否發生作為因變量，以FIGO分期、浸潤深度、淋巴結轉移、miR-335-5p、ATF2及MMP2作為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示miR-335-5p、ATF2及MMP2均為影響宮頸癌的危險因素，見表5。

表5 影響宮頸癌的多因素分析

2.5宮頸癌癌組織中miR-335-5p、ATF2及MMP2表達的相關性:Pearson法分析結果顯示，宮頸癌患者癌組織中miR-335-5p與MMP2的表達呈明顯正相關(r= 0.490，P<0.05)，見圖1；ATF2與MMP2的表達呈明顯正相關(r=0.424，P<0.05)，見圖2；miR-335-5p與ATF2的表達呈明顯正相關(r=0.860，P<0.05)，見圖3。

圖1 宮頸癌癌組織中miR-335-5p、MMP2表達的相關性

圖2 宮頸癌癌組織中ATF2、MMP2表達的相關性

圖3 宮頸癌癌組織中miR-335-5p、ATF2表達的相關性

3 討 論

miRNA可調控一個或多個信使RNA，從而調控其編碼的蛋白質，在細胞形成的過程中起重要作用。大量研究證明，不同的miRNA在腫瘤中異常表達，具有抑癌或致癌的作用，在疾病的發展進程中發揮不同的作用[8]。miRNA可作為腫瘤診斷、治療及預后的標志物，是近年來的研究熱點。miR-335-5p位于人染色體7q32.2處，可調節細胞的生理活動，在人體組織器官中廣泛表達，并在多種腫瘤中異常表達，發揮抑癌或促癌作用[9]。研究表明，miR-335-5p能抑制Bcl-w蛋白表達，從而抑制MMP2蛋白表達，在卵巢癌中發揮抑癌作用[10]。而本研究結果顯示，實驗組中miR-335-5p表達水平均明顯高于對照組，提示miR-335-5p可能參與宮頸癌的發生發展。另外本研究通過進一步分析miR-335-5p表達水平與臨床病理特征的關系分析顯示，宮頸癌患者癌組織miR-335-5p與FIGO分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關，此結果進一步說明miR-335-5p參與宮頸癌的發生發展，且與疾病的侵襲轉移密切相關。

ATF2位于人染色體2q32處，含有兩個功能結構域：氨基端反式激活域和羧基端DNA結合域。ATF2在人體內各組織器官中表達量不盡相同，在腦組織中表達最高。研究表明，ATF2參與細胞生理活動，如染色質重塑、DNA損傷應答、轉錄調節等，在腫瘤中發揮致癌或抑癌的作用[11]。有報道稱，下調ATF2的表達可抑制結腸癌細胞侵襲和遷移[12]。另有研究顯示，ATF2磷酸化可激活器下游的靶蛋白泛素特異性蛋白酶14，從而促使前列腺癌細胞侵襲和遷移[13]。而本研究結果顯示，實驗組中ATF2 mRNA和MMP2 mRNA的表達水平均明顯高于對照組，且實驗組ATF2蛋白和MMP2蛋白的陽性表達率明顯高于對照組，提示ATF2和MMP2可能參與宮頸癌的發生發展；同時宮頸癌患者癌組織ATF2和MMP2的表達水平均與FIGO分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關。另外通過對宮頸癌患者進行Logistic多因素回歸分析，miR-335-5p、ATF2和MMP2均是影響宮頸癌的危險因素，提示下調miR-335-5p、ATF2和MMP2的表達可能會對宮頸癌起到抑制作用；宮頸癌組織中miR-335-5p、ATF2和MMP2三者的表達量兩兩間均呈正相關，提示三者之間可能存在有相互調控機制，共同作用影響宮頸癌的發生發展。

綜上所述，miR-335-5p、ATF2在宮頸癌組織中表達上調，二者的表達水平與FIGO分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關，且二者可能共同作用影響宮頸癌的發生發展。但本次研究的不足之處在于納入的樣本量較少，日后會繼續收集樣本，擴大樣本量，對miR-335-5p、ATF2與子宮肌瘤的發生發展進行深入研究，期望日后可為宮頸癌的臨床診斷及治療提供更有價值的參考依據。