lncRNA CCHE1與肺腺癌臨床特征及預后的關系研究

唐榮彬， 王 剛

(大連大學附屬中山醫院腫瘤科， 遼寧 大連 116001)

我國自2010年來，癌癥已取代心血管疾病成為主要的死亡原因，其中肺癌的發病率和死亡率高居首位，2014年我國肺癌發病率為57.13/10萬，死亡率為45.80/10萬[1]。早期肺癌臨床表現無明顯特異性，大部分患者確診為肺癌時往往已進入中晚期。因此，肺癌的早期篩查對于其治療及預后有重要的臨床意義。根據其組織學特點，肺癌可以分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中80%的肺癌均為NSCLC，而NSCLC又以腺癌較為常見。大量數據表明[2,3]，腫瘤的局部進展、復發以及轉移是預后不良的主要原因。長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNAs，lnc RNAs)是體內不參與蛋白編碼的一類長鏈RNA分子，研究發現lnc RNAs在腫瘤的發生發展中有重要的調控作用。lnc RNA CCHE1(cervical carcinoma high-expressed 1，CCHE1)是一個新近鑒定一種lnc RNA，Yang M等[4]在宮頸癌組織中進行lnc RNA篩查，發現一種高表達lnc RNA(定義為lnc RNA CCHE1)，其表達與患者臨床病理特征密切相關，可預測宮頸癌患者預后，其在宮頸癌中表現出促癌作用。近期研究發現，lnc RNA CCHE1可促進非小細胞肺癌的增殖、轉移和侵襲，對非小細胞癌的預后有一定預測作用[5]。但國內關于lnc RNA CCHE1和肺腺癌的報道較少，故本研究旨在觀察lnc RNA CCHE1在肺腺癌中的表達情況，并分析其表達與患者臨床病理特征及預后的關系，為肺腺癌的早期診斷、治療及預后判斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2015年12月至2016年12月行手術切除的肺腺癌患者83例，收集其肺癌組織和癌旁正常組織蠟塊，肺癌組織經病理檢測確診，癌旁正常組織距離病灶>5cm。其中男45例，女38例；年齡35～79歲，平均年齡(58.26±7.45)歲；TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期13例，Ⅲ期39例，Ⅳ期6例；淋巴結轉移：存在淋巴結轉移35例，無淋巴結轉移48例；分化程度：高分化29例，中分化34例，低分化20例。本研究已通過醫院倫理委員會審批，且患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2方 法

1.2.1qRT-PCR法檢測lnc RNA CCHE1的表達：取適量肺癌組織和癌旁正常組織，加入Trizol裂解液(美國Invitrogen公司)，室溫下勻漿；采用氯仿-異丙醇體系提取其總RNA，測定其純度、濃度及完整度；參照逆轉錄試劑盒(美國GeneCopoeia公司)說明書，將提取總RNA逆轉錄為cDNA鏈；取等量cDNA模板，混入SYBR Green PCR Master Mix(美國Thermo Scientific公司)上qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)進行檢測，采用2-ΔΔCT法，以GADPH的表達為內參，計算組織標本中lnc RNA CCHE1的相對表達量，作3次獨立重復試驗。條件設置：95℃預變性20s，95℃變性15s，60℃退火45s，72℃延伸2min，共40個循環。內參GAPDH上游引物：5 ’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物：5’-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3’[6]。lnc RNA CCHE1上游引物：5’-AAGGTCCCAGGATACTCGC-3’，下游引物：5’-GTGTCGTGGACTGGCAAAAT-3’[7]。基因引物合成由江蘇百奧邁科生物技術有限公司提供。

1.2.2隨訪：隨訪截止至2019年12月31日，以門診復查、電話的形式記錄患者預后情況，包括無進展生存期(progression free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)，PFS是指受試者入組到腫瘤發生惡化或死亡的時間，OS是指受試者入組到死亡的時間[8]。隨訪頻率：術后第1年，1次/月；術后第2年，1次/3個月；術后第3年，1次/半年。

2 結 果

2.1lnc RNA CCHE1在肺腺癌組織及癌旁組織的表達：肺腺癌組織中lnc RNA CCHE1的相對表達量為(65.26±5.84)，癌旁組織中為(21.34±1.68)；肺腺癌組織中lnc RNA CCHE1的表達明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2lnc RNA CCHE1表達與患者臨床病理特征的關系：不同性別、年齡的肺腺癌患者lnc RNA CCHE1的表達情況，差異無統計學意義(P>0.05)；而不同TNM分期、淋巴結轉移及分化程度患者lnc RNA CCHE1的表達情況，差異有統計學意義(P<0.05)，高TNM分期、存在淋巴結轉移及低分化程度的患者lnc RNA CCHE1表達量明顯高于低TNM分期、無淋巴結轉移及高分化程度者(P<0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征患者lnc RNA CCHE1表達的比較

2.3lnc RNA CCHE1對肺腺癌的鑒別價值：lnc RNA CCHE1診斷為肺腺癌的AUC為0.925(95%CI為0.876～0.974)，當lnc RNA CCHE1≥29.18時，敏感度為94.0%，特異度為89.2%，見圖1。

2.4lnc RNA CCHE1表達與肺腺癌患者預后的關系：截止2019年12月30日，入組病例死亡22例，存活61例；比較發現死亡者lnc RNA CCHE1表達為(73.15±8.45)，明顯高于存活者(59.37±5.19)，差異有統計學意義(t=8.934，P<0.001)。

根據上述ROC分析結果，取其臨界值(29.18)將患者區分為lnc RNA CCHE1高表達和低表達，分別有67例和16例。lnc RNA CCHE1高表達患者術后3年中位PFS為19.8個月，3年無進展生存率為32.84%(22/67)，總生存率為68.66%(46/67)。lnc RNA CCHE1低表達患者術后3年無進展生存率為81.25%(13/16)，總生存率為93.75%(15/16)。lnc RNA CCHE1高表達患者術后3年無進展生存率(Log-rank χ2=11.010，P<0.001)和總生存率(Log-rank χ2=3.899，P=0.048)明顯低于lnc RNA CCHE1低表達者，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.5肺腺癌患者術后生存時間的影響因素分析：以患者預后結局為因變量，對自變量年齡(<60為1，≥60為2)、TNM分期(Ⅰ期為1，Ⅱ期為2，Ⅲ期為3，Ⅳ期為4)、淋巴結轉移(無淋巴結轉移為0，有淋巴結轉移為1)、分化程度(高分化為1，中分化為2，低分化為3)及lnc RNA CCHE1水平(低表達為1，高表達為2)進行賦值，納入Cox模型進行分析，結果顯示TNM分期、淋巴結轉移、分化程度及lnc RNA CCHE1水平是肺腺癌患者術后3年PFS和OS的獨立影響因素，見表2。

表2 肺腺癌患者術后預后的影響因素分析

圖1 lnc RNA CCHE1對肺腺癌的鑒別價值

圖2 肺腺癌患者不同lnc RNA CCHE1水平的生存曲線

3 討 論

肺腺癌已成為肺癌最常見的病理類型，占所有肺癌的30%左右，主要起源于支氣管腺體或上皮。臨床表現以干咳、胸痛、氣急等胸部癥狀為主，影像學檢查可見圓形或橢圓形腫塊[9]。但其早期癥狀缺乏特異性，容易被忽視，而且早期肺腺癌有血行轉移的風險。因此，早發現、早診斷、早治療對改善患者預后有重大的臨床意義，可有效提高患者5年生存率。另外，不同類型的肺癌治療方法不同，準確判斷腫瘤病理分型也是治療的關鍵。

隨著分子技術的發展，分子靶向治療為失去手術指征的晚期肺腺癌患者帶來了新的治療希望。人類全基因組中但僅有不足2%的基因組編碼蛋白，而90%以上的基因轉錄本均為非編碼RNAs，參與高級真核生物表觀遺傳學的調控。根據非編碼RNAs的長度，將大于200個核苷酸的非編碼RNAs定義為lnc RNAs。研究發現[10]，lnc RNAs可參與腫瘤的生物學調控，對于腫瘤的診斷、治療及預后極具價值。lnc RNA CCHE1最初在宮頸癌組織發現，位于第10 號染色體基因間區。據報道[11]，lnc RNA CCHE1在宮頸癌組織中異常高表達，而且與患者腫瘤大小、FIGO分期及預后密切相關。隨后，lnc RNA CCHE1被報道在肝癌、非小細胞肺癌和胃癌中具有促癌作用[12]。機制研究方面，lnc RNA CCHE1可通過PCNA、活化ERK/MAPK等途徑促進宮頸癌細胞的增殖。上述研究表明，lnc RNA CCHE1在體內可能具有某種促癌作用，但國內尚無lnc RNA CCHE1與肺腺癌的相關報道。

本研究結果顯示，肺腺癌組織中lnc RNA CCHE1水平明顯高于癌旁組織。進一步分析其水平與患者臨床病理特征關系發現，高TNM分期、存在淋巴結轉移及低分化程度患者lnc RNA CCHE1表達更高。上述結果表明，lnc RNA CCHE1在肺腺癌中可能存在某種調控機制，與其發生發展密切相關。ROC曲線分析結果顯示，lnc RNA CCHE1水平對于肺腺癌有較高的診斷價值，提示lnc RNA CCHE1水平可輔助用于臨床肺腺癌的早期診斷，但本研究屬于單一中心、小樣本量研究，后續還需要開展多中心研究，深入研究lnc RNA CCHE1診斷肺腺癌的臨界值。Kaplan-Meier 生存分析結果表明，Lnc RNA CCHE1高表達患者術后3年PFS生存率和OS生存率明顯低于Lnc RNA CCHE1低表達者。Cox模型分析結果顯示，Lnc RNA CCHE1高表達也是肺腺癌患者預后不良的獨立影響因素。上述結果表明，Lnc RNA CCHE1可能作為判斷肺腺癌患者預后的潛在分子標志物。

由于肺癌的惡性程度高，病情進展迅速，肺癌的早期診斷仍存在較大的困難。臨床數據顯示，約有40%的患者確診時，已發生遠處轉移，而錯過最佳治療時機[13]。本研究初步揭示了Lnc RNA CCHE1在肺腺癌中呈高表達，且與患者臨床病理特征及預后關系密切，但其具體的生物學功能和相應的分子機制還需要深入分析。本研究后期將以Lnc RNA CCHE1為靶點，嘗試探索潛在的治療途徑，為肺腺癌的治療提供新方向。