Treg/Th17細胞失衡及相關細胞因子表達水平與再生障礙性貧血的關系分析

王 蕊, 董彩麗, 趙云婷*, 王 艷

(1.河北省第七人民醫院檢驗科, 河北 保 定 0730002.河北醫科大學第二醫院血液內科, 河北 石家莊 050000)

再生障礙性貧血(Aplastic anemia，AA)是臨床上常見的血液系統疾病，主要以骨髓增生及全血細胞減少為特征，表現為出血、貧血及感染傾向[1]。AA發病機制尚不明確，可能與免疫系統異常有關，尤其是CD4+T細胞功能紊亂在AA發病中起到重要促進作用[2]。Treg細胞是一種重要的CD4+T細胞，具有免疫調節、免疫抑制作用，可維持機體自身免疫耐受[3]。Th17細胞也屬于CD4+T細胞，具有促炎、誘導自身免疫性疾病等作用，與Treg細胞相互制約，保持動態平衡，以維持機體穩態。有臨床研究發現，AA患者外周血Treg/Th17處于失衡狀態，認為Treg/Th17失衡是AA發病機制中的重要環節[4]，但關于Treg/Th17細胞失衡及其相關細胞因子與AA疾病程度、預后的關系研究尚少。鑒于此，本研究選取近2年收治的AA患者為研究對象，觀察其外周血Treg、Th17、Treg/Th17及相關細胞因子水平變化，旨在探討外周血Treg、Th17、Treg/Th17水平及相關細胞因子與AA疾病程度及預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2016年12月至2018年6月期間合作醫院收治的AA患者為研究對象，納入標準：①均為初診再生障礙貧血，結合臨床表現、血象及骨髓象進行診斷，符合《血液病診斷及療效標準》[5]中AA診斷要求；②入組前1個月內未接受相關治療；③患者對本研究充分知情，并自愿簽署病人知情同意書。排除標準：①合并急性感染或其他自身免疫系統疾病者；②合并惡性腫瘤者；③非初診者；④懷孕或哺乳期女性。納入研究者共94例，根據Camitta分型標準[6]確定AA嚴重程度，并將患者分為輕型AA(mild AA，MAA)組和重型AA(severe AA，SAA)組，其中SAA骨髓有核細胞百分率<0.25，若≥0.25但<0.50，則殘存的造血細胞應<30%；且具備下列3項中至少2項：中性粒細胞<0.5×109L-1；校正的網織紅細胞<1%或網織紅細胞絕對值<20×109L-1；血小板<20×109L-1。MAA組41例，其中男性24例，女性17例，年齡15～81歲，平均(48.38±10.49)歲，SAA組53例，其中男性28例，女性25例，年齡14～79歲，平均(49.11±10.98)歲。另選取同期體檢健康者50例為對照組，其中男性29例，女性21例，年齡22～69歲，平均(47.71±10.01)歲。各組性別、年齡相似(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準同意。

1.2主要試劑:Cy5標記的抗人CD3和CD4單克隆抗體，FITC標記的抗CD8和CD25單克隆抗體，PE標記的抗人白介素(Interleukin，IL)-17和CD127單克隆抗體均購自美國BD公司；IL-10、IL-6和IL-17酶聯免疫吸附試劑盒購自美國R&D公司。

1.3外周血Treg、Th17水平檢測:采集受試者外周靜脈血10～12 mL于抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，制備濃度為1×106PBMC細胞懸液，取1 mL加入24孔板，再加入20 ng/mL佛波酯、1ug/mL離子霉素、2nmol/mL莫能菌素，于5% CO2，37℃培養箱中放置4h。Treg、Th17采用流式細胞術檢測，具體操作步驟見文獻[7]。

1.4血清相關細胞因子檢測:采集所有受試者外周血4～5mL，不進行抗凝處理，室外靜置20min后，3000rpm離心10min，小心收集上清，于-80℃保存。采用酶聯免疫吸附法檢測血清IL-10、IL-6和IL-17表達水平。

1.5隨訪:對AA患者進行8～12個月的隨訪，隨訪方式為電話或門診，記錄患者預后不良(急性復發或死亡)情況。復發標準：①骨髓細胞增生程度低于正常的1/4；②血小板絕對數<20×109L-1，網織紅細胞絕對數<20×109L-1，中性粒細胞絕對值<0.5×109L-1，血象至少具備以上2項。

2 結 果

2.1各組外周血Treg、Th17及Treg/Th17水平比較:各組外周血Treg、Th17及Treg/Th17水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，SAA組Treg細胞水平、Treg/Th17低于對照組和MAA組，Th17水平高于對照組和MAA組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組外周血Treg Th17及Treg/Th17水平比較

2.2各組血清細胞因子細胞因子水平比較:各組血清IL-10、IL-6和IL-17水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，SAA組IL-10水平低于對照組和MAA組，IL-6和IL-17水平高于對照組和MAA組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組血清細胞因子細胞因子水平比較

表3 Treg/Th17細胞失衡及相關細胞因子與AA病情嚴重程度關系

2.3Treg/Th17細胞失衡及相關細胞因子與AA病情嚴重程度關系:Treg、Treg/Th17及IL-10水平與疾病嚴重程度呈負相關(P<0.05)，Th17、IL-6和IL-17與疾病嚴重程度呈正相關(P<0.05)，見表3。

2.4Treg/Th17細胞失衡及相關細胞因子與AA預后的關系:94例再生障礙貧血患者隨訪期間24例死亡，急性復發17例，以病情程度(MAA=0、SAA=1)、Treg、Th17、Treg/Th17、IL-10、IL-6及IL-17(連續變量不賦值，按實際值分析)為自變量，以預后情況為因變量(未出現急性復發或死亡=0，急性復發或死亡=1)，采用多元Logitic回歸模型進行分析，結果顯示，除病情程度以外，Treg和Treg/Th17是不良預后(急性復發或死亡)的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 Treg/Th17細胞失衡及相關細胞因子與AA預后的關系

3 討 論

AA是一種由多種原因(物理、化學、生物)引起的血液系統疾病，包括遺傳性AA和獲得性AA，發病機制可能與免疫功能紊亂、造血干細胞缺陷、造血微環境異常等有關。近期越來越多研究認為，AA在某種程度上可看做一種自身免疫性疾病，靶抗原為造血系統，且采用免疫抑制治療取得一定療效，也說明AA發病與免疫功能紊亂密切相關[8]。但免疫功能紊亂是如何導致AA發病以及如何影響疾病進展尚未完全明確。

CD4+T細胞是機體免疫功能調控中心，CD4+T細胞水平升高，CD4+T細胞和CD8+T細胞比例向CD4+T細胞免疫偏移，造血微環境中相關細胞因子分泌異常，最終引起造血功能衰竭[9]。Treg細胞可抑制CD4+T細胞增殖，是調節CD4+T細胞和CD8+T細胞平衡的關鍵因素，從而維持自身免疫耐受，并發揮抗炎作用[10]。有研究以SAA模型小鼠為研究對象，采用雷帕霉素干預，結果發現雷帕霉素可通過抑制Treg細胞凋亡，恢復小鼠骨髓造血功能，提示上調Treg細胞有助于改善骨髓造血功能[11]。本研究中，SAA組Treg細胞水平明顯低于對照組和MAA組，且Treg細胞水平與AA嚴重程度呈負相關，即Treg細胞水平越低，AA病情越嚴重。由此可見，AA患者外周血Treg細胞水平明顯下調，且通過監測Treg細胞水平可判斷病情嚴重程度。進一步分析發現，AA患者IL-10水平明顯降低，提示患者Treg細胞免疫功能受到抑制，分析原因可能在于IL-10是Treg細胞分泌的細胞因子，IL-10具有抗炎作用，并可抑制γ-干擾素、TNF-α生成，進而調控自身免疫性疾病，但具體機制仍需深入探究。

Th17細胞是一種新發現的CD4+T細胞亞群，其主要通過分泌IL-6、IL-17等細胞因子使更多炎癥細胞聚集于靶區，對造血干細胞造成損傷，誘導其凋亡，或通過分泌細胞毒性物質直接損傷造血干細胞[12]。因此我們認為Th17、IL-6、IL-17可能與AA患者免疫功能紊亂有關，分析發現，SAA組Th17、IL-6、IL-17水平均明顯高于對照組和MAA組，且與疾病嚴重程度呈正相關，證實SAA患者Th17及其相關細胞因子水平明顯上調，推測與Th17細胞介導炎癥反應，使機體出現免疫亢進有關。相關薈萃研究顯示，當Th17分泌大量IL-6后，IL-6可進一步促進初始CD4+T細胞分化為Th17，同時通過抑制Foxp3表達影響Treg細胞功能，所以Treg/Th17細胞失衡可能是由細胞因子水平失調造成[13]。郝慧琴[14]等研究發現，系統性紅斑狼瘡患者Th17水平明顯高于健康者，Treg細胞水平明顯低于健康者，認為T17/Treg比值是系統性紅斑狼瘡病情評估的重要參考指標。由此認為，Treg/Th17失衡可引起自身免疫疾病發生。本研究結果顯示，SAA組Treg/Th17低于對照組和MAA組，且與國外學者Li[15]等研究結果相似，均表明Treg/Th17失衡與AA尤其是SAA有緊密關聯。基于以上分析，本研究通過進一步Logitic回歸模型分析Treg/Th17與AA預后的關系，發現除病情程度以外，Treg和Treg/Th17是急性復發或死亡的獨立危險因素，主要原因在于Treg/Th17失衡程度與病情程度相關，因此認為監測Treg/Th17水平對于預測疾病嚴重程度和疾病預后具有重要參考價值。但本研究樣本量有限，影響AA的預后因素可能還與臨床治療及患者的個體差異有關，相關論點仍有待進一步論證。

綜上所述，Treg/Th17細胞失衡在AA疾病發生機制中起到重要作用，在AA患者機體中，Treg細胞免疫應答減弱，Th17細胞免疫應答增強，Treg/Th17向Th17細胞免疫應答偏移，且Treg/Th17失衡越嚴重，AA病情越嚴重，預后越差，可能為臨床監測、診治提供新的途徑。