長鏈非編碼RNA AC007271.3與TSGF、SCCA等聯(lián)合檢測對口腔鱗癌的診斷價值

邵婷如 陳細婷 鄭則楠 黃光釗 呂曉智

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 廣州 510515)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤[1-2]，不僅嚴重破壞患者口腔頜面部的外形，影響美觀及吞咽、咀嚼和語言等功能，還危及患者生命安全[2-3]。盡管OSCC發(fā)病位置相對表淺，但臨床上大多數患者就診時已是晚期。雖然目前放療、化療、手術治療、靶向治療和免疫治療等已經取得了一定的進展，但晚期OSCC的治療效果并不滿意，晚期OSCC患者的5年生存率為40%～50%[4-5]。因此，OSCC的早期和精準診斷對于提高OSCC患者的預后至關重要。

前期通過對OSCC及癌旁配對正?？谇火つそM織標本基因芯片進行檢測發(fā)現，長鏈非編碼RNA(lncRNA)AC007271.3在OSCC中異常高表達[6]，并可通過Wnt/β-catenin信號通路促進OSCC的生長、侵襲以及遷移[7]。進一步研究發(fā)現，lncRNA AC007271.3由OSCC腫瘤細胞分泌，在OSCC患者的血清中呈穩(wěn)定表達，并且手術后患者血清中的AC007271.3顯著降低，提示AC007271.3可能是一種有效的OSCC腫瘤診斷標志物[6-7]。而鱗狀細胞癌抗原(SCCA)、癌胚抗原(CEA)以及腫瘤特異性生長因子(TSGF)是目前臨床常用的腫瘤診斷標志物[8-10]。本課題組前期的研究曾發(fā)現AC007271.3、SCCA及TSGF在OSCC患者血清中異常表達，對OSCC具有一定的臨床診斷價值[6]，但是研究的樣本量相對較少，因此本研究進一步擴大樣本量，通過比較OSCC患者以及健康者血清中AC007271.3、SCCA、TSGF和CEA的表達情況，探討上述腫瘤標志物對OSCC患者早期診斷及預后評估的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇我院2014年9月—2019年9月收治并診斷為OSCC的患者共160例作為研究組(所有患者入組前均未接受過放化療或其他抗腫瘤治療，并經我院病理檢查確診為OSCC且均為原發(fā)病灶)，其中Ⅰ～Ⅱ期OSCC患者97例，Ⅲ～Ⅳ期OSCC患者63例；另選擇同期于我院體檢健康者160例作為對照組。本項研究經我院倫理委員會批準(倫理號：AF/SC-09/03.2)。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料的收集 收集OSCC患者的一般資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤TNM分期、腫瘤病理分化程度、淋巴結轉移情況等。

采用實時定量PCR法檢測所有研究對象血清中AC007271.3的表達水平。使用TRIzol LS試劑(Ambion公司，Waltham，MA，美國)自患者血清中提取總RNA，逆轉錄試劑盒(RR047A,Takara公司,日本)以及熒光定量試劑盒(RR820A,Takara公司,日本)進行逆轉錄和PCR擴增。采用StepOne Plus實時定量PCR儀進行兩步法擴增反應，數據經導出后，采用2-△△CT法進行分析。具體引物序列見表1。

表1 引物名稱和序列

1.3 血清中各指標診斷價值的評估

通過ROC曲線下面積(AUC)、診斷特異度及診斷靈敏度分別評估AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA單獨檢測以及各標志物間聯(lián)合檢測對OSCC的診斷價值。采用Cox比例風險模型及Kaplan-Meier生存曲線評估AC007271.3高表達和低表達與OSCC患者預后的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0(IBM, Armonk, NY, USA)及GraphPad Prism 5.0(La Jolla, CA, USA)進行數據分析。同組樣本間比較采用配對t檢驗或方差分析，組間比較采用非參數Mann-WhineyU檢驗或Welch檢驗。聯(lián)合檢測采用二元Logistic回歸分析，通過ROC曲線評估各指標的診斷價值。采用Cox比例風險模型及Kaplan-Meier生存曲線分析OSCC患者預后情況。所有檢測均為雙尾，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血清中AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA水平與OSCC患者臨床病理特征的關系

實時定量PCR方法檢測結果顯示，研究組和對照組患者的血清中AC007271.3表達水平分別為914.3±313.2、1.840±0.3419，研究組顯著高于對照組(t=2.598,P<0.05)。并且Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期OSCC患者血清中AC007271.3的表達水平呈明顯差異(t=2.547,P<0.05)。腫瘤不同TNM分期、不同分化程度、有無區(qū)域淋巴結轉移的OSCC患者血清中AC007271.3、TSGF及SCCA的表達差異具有顯著性(t=2.239～4.209,P<0.05)。另外，AC007271.3表達同時與患者是否吸煙有關(t=2.598,P<0.05)。而血清中CEA表達與OSCC患者臨床病理特征無明顯關系(P>0.05)。見表2。

表2 血清中不同檢測指標與OSCC患者臨床病理特征的關系

2.2 血清腫瘤標志物聯(lián)合檢測對OSCC診斷價值

AUC顯示，AC007271.3對OSCC的診斷價值最高(AUC為0.877)，診斷靈敏度為80.0%，診斷特異度為83.1%，其次為SCCA(AUC為0.792)，診斷靈敏度為66.9%，診斷特異度為87.5%(圖1)。AC007271.3+SCCA、AC007271.3+TSGF以及AC007271.3+CEA聯(lián)合檢測對OSCC診斷價值均高于SCCA、TSGF、CEA的單獨檢測(圖2)。其中，SCCA+AC007271.3聯(lián)合檢測對OSCC的診斷價值最高(AUC為0.927)，診斷靈敏度為80.6%，診斷特異度為92.5%；AC007271.3+SCCA+TSGF聯(lián)合檢測診斷特異度較SCCA+AC007271.3聯(lián)合檢測低，但其曲線下面積更具優(yōu)勢(AUC為0.932)(表3)；同時SCCA+AC007271.3聯(lián)合檢測對Ⅰ～Ⅱ期OSCC的診斷價值最高(AUC為0.960)。生存分析研究結果顯示，血清中AC007271.3高表達OSCC患者預后較差(χ2=4.792，HR=2.507，95%CI=1.097～4.206,P<0.05)(圖3)。

圖1 血清中AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA診斷OSCC的ROC曲線

a、b、c分別為SCCA、TSGF、CEA單獨檢測及其與AC007271.3聯(lián)合檢測的ROC曲線

圖3 血清中AC007271.3表達水平與OSCC患者總生存率的關系

表3 OSCC患者血清中不同檢測指標診斷價值的評估

3 討 論

目前研究證明，lncRNA是一類位于細胞核或細胞質內，長度大于200個核苷酸的不具有可讀框的轉錄本，在組蛋白乙酰化、基因甲基化、轉錄后翻譯等生物學過程中發(fā)揮著重要作用，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵調控因子[11-13]。同時研究表明，lncRNAs可以從腫瘤組織釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，在癌癥患者的血液、尿液和唾液中均可檢測到，由此提示一些游離lncRNA可能攜帶與腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移等有關的信號因子，可作為潛在的腫瘤標志物[14-18]。血清中的循環(huán)lncRNAlinc00152、CFLAR-AS1以及POU3F3均可作為人食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的腫瘤標志物[19-21]。胃癌患者血清中的循環(huán)lncRNAAK001058、INHBA-AS1、MIR4435-2HG、UCA1和CEBPA-AS1的水平顯著高于健康對照組[22]。而關于OSCC患者血清中l(wèi)ncRNA檢測的相關報道較少。

前期研究證實，AC007271.3在OSCC組織中異常表達，由OSCC細胞進行分泌，在OSCC患者血清中穩(wěn)定表達，并且手術以后OSCC患者血清中AC007271.3表達水平顯著降低，是OSCC液體活檢的一個潛在腫瘤標志物。本研究擴大樣本量，進一步檢測AC007271.3及幾種傳統(tǒng)腫瘤標志物SCCA、CEA和TSGF在研究組及對照組血清中的表達情況。結果顯示，研究組患者血清中AC007271.3的表達水平顯著高于對照組。進一步分析發(fā)現，AC007271.3的表達水平分別與患者吸煙史、腫瘤TNM分期、分化程度、淋巴結轉移相關，并且其表達水平越高，患者預后越差，提示AC007271.3可作為OSCC診斷及預后評估的新型腫瘤標志物。這些結果與本課題組前期研究結果一致[6]，進一步提示了AC007271.3在OSCC患者精準診斷和預后評估中的價值。

目前臨床診斷OSCC的腫瘤標志物較少，傳統(tǒng)的血清標志物如SCCA、TSGF、CEA等已被用作多種腫瘤早期診斷的臨床標志物[23]。研究表明，血清SCCA是一種診斷特異度較高可用于鱗癌診斷的腫瘤標志物，其血清水平與腫瘤進程相關，術后患者血清SCCA水平較術前顯著降低，而50%患者血清SCCA水平升高可先于臨床診斷復發(fā)，但其診斷靈敏度不高[6-7,24]。本研究中，血清中SCCA水平與OSCC患者腫瘤TNM分期、分化程度及淋巴結轉移有關，ROC曲線分析提示SCCA對OSCC患者診斷特異度較高，但其診斷靈敏度欠佳，與文獻中報道的結果基本一致[24]。TSGF是一種廣譜腫瘤標志物，在急性炎癥、膠原疾病和其他臨床疾病中血清水平均較高[25]。本研究發(fā)現TSGF在Ⅲ～Ⅳ期、有區(qū)域淋巴結轉移、術后病理提示腫瘤為低分化的OSCC患者血清中顯著高表達。CEA也是一種廣譜腫瘤標志物，但其診斷特異度不強，診斷靈敏度不高，對早期頭頸部惡性腫瘤診斷價值不大[26]。本研究中血清中CEA的表達與OSCC患者臨床病理特征并無明顯差異。由于單項腫瘤標志物檢測診斷靈敏度和診斷特異度具有一定局限性，而且傳統(tǒng)腫瘤標志物的水平通常受到許多其他疾病和因素的影響[27]。因此，本研究又進一步采用ROC曲線分析AC007271.3及SCCA、CEA和TSGF聯(lián)合檢測對于OSCC患者的診斷價值，結果發(fā)現，AC007271.3+SCCA聯(lián)合檢測以及AC007271.3+SCCA+TSGF聯(lián)合檢測的價值均高于單獨檢測AC007271.3、SCCA和TSGF，其中，AC007271.3+SCCA+TSGF聯(lián)合檢測對OSCC具有較高的診斷靈敏度和診斷特異度，診斷價值最高，和本課題組前期研究結果一致[6]。這為臨床OSCC患者的早期診斷和預后評估提供了一種新的策略，有利于提高對OSCC患者的早期診斷和預后評估。

綜上所述，本文研究的結果提示血清中的AC007271.3、SCCA以及TSGF是OSCC患者精準診斷、治療、預后評估的腫瘤標志物，同時聯(lián)合檢測AC007271.3+SCCA+TSGF可以有助于提高對OSCC患者診斷效率，可為OSCC的早期診斷、治療及預后評估提供參考。