CPP-ACP在三聚磷酸鈉輔助下對脫礦牙本質仿生再礦化的影響

周洲 李玉芝 卞敏霞 葛興云 于金華

(南京醫科大學口腔疾病研究江蘇省重點實驗室，南京醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓科，江蘇 南京 210029)

牙本質的仿生再礦化是一種在仿生分子的調控下，模擬生物自然礦化過程，是在脫礦牙本質基質或晶體表面形成新礦化物質，從而修復脫礦區的微創治療手段[1-3]。牙本質仿生再礦化不但可以治療牙本質過敏，還可以阻止齲病的早期發展，起到防齲護齒的作用[4-6]。

仿生再礦化與仿生分子的選擇密切相關，酪蛋白磷酸肽-納米無定形磷酸鈣(CPP-ACP)是從牛奶中經胰蛋白酶消化提取出來的多肽復合物[7]，是一種具有良好的生物相容性的仿生分子，可使鈣和磷酸根離子保持過飽和濃度從而進入牙體脫礦區，起到抑制牙體脫礦以及促進再礦化的作用[8-10]。CPP-ACP以往多用于牙釉質的再礦化中，并取得了一定的再礦化效果[11-13]，但在牙本質的再礦化中報道較少，可能是由于單獨使用CPP-ACP無法模擬牙本質的生物自然礦化過程，從而無法獲得理想的再礦化效果。三聚磷酸鈉(TPP)是一種無定形水溶性線狀聚磷酸鹽，不僅具有良好的生物相容性，同時也可以作為牙本質非膠原蛋白仿生類似物即仿生分子使用。TPP可以通過磷酸化牙本質膠原纖維，增加膠原表面成核位點來誘導膠原礦化，實現與膠原微纖維的特異性結合[14-15]。本研究旨在通過CPP-ACP在TPP輔助下對脫礦牙本質進行仿生再礦化，從而探討再礦化效果。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

CPP-ACP乳劑(GC公司，日本)，TPP(分析純，國藥集團試劑有限公司)，35%磷酸凝膠(Gluma Etch 35 Gel，Heraeus公司，德國)，離體牙(南京醫科大學附屬口腔醫院外科收集)，人工模擬唾液(以ISO/TR10271為標準配方配置)，衰減全反射傅里葉變化紅外光譜儀(NEXUS670，Nicolet公司，美國)，低速切割機(Isomet，Buehler公司，美國)，掃描電子顯微鏡(SU3500，HITACHI公司，日本)，能譜分析儀(AZtecEnergy，Oxford Instruments公司，英國)，透射電鏡(Tecnai Spirit 120 kV，FEI公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1脫礦牙本質樣片的制備 收集口腔門診外科拔除的患者的完整第三磨牙，排除齲壞裂紋等，去除表面牙釉質，以慢速切割機垂直牙長軸切割制成4 mm×4 mm×1 mm大小的牙本質樣片30片，用不同細度的砂紙依次打磨光滑，放入超聲清洗機中去離子水超聲清洗5 min，備用。其中6片作為陽性對照不做任何處理；其余24片牙本質樣片先以35%磷酸凝膠涂抹表面60 s致牙本質脫礦；脫礦的牙本質樣片在超聲清洗機中通過去離子水清洗，干燥備用。

1.2.2牙本質樣片的分組以及處理 將牙本質樣片根據處理方法不同隨機分成5組，每組各6片。CPP-ACP再礦化組(A組)：將脫礦牙本質樣片實驗面均勻涂抹CPP-ACP乳劑2 min，去離子水沖洗干凈后，放入15 mL盛有模擬唾液的試管中，試管置入37 ℃恒溫水浴鍋中，每24 h涂抹3次，每次間隔8 h，每次均更換模擬唾液，共作用21 d，取出牙本質樣片，超聲清洗機中去離子水清洗2 min，干燥后備用；CPP-ACP+TPP聯合再礦化組(B組)：在A組的基礎上，先將脫礦牙本質樣片浸入25 g/L TPP的溶液中2 h，清洗干燥后，再涂抹CPP-ACP 乳劑2 min；單獨模擬唾液再礦化組(C組)：將脫礦牙本質樣片放入15 mL盛有模擬唾液的試劑管中，試管置入37 ℃恒溫水浴鍋中，每24 h更換模擬唾液，作用21 d后將礦化的牙本質樣片取出，超聲清洗機中去離子水清洗2 min，干燥以后備用；陰性對照組(D組)：脫礦牙本質樣片不做任何處理；陽性對照組(E組)：沒有任何處理的天然牙本質樣片。

1.2.3牙本質樣片表面的官能團檢測分析 采用衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)對天然牙本質樣片、脫礦牙本質樣片、TPP處理的脫礦牙本質樣片(脫礦牙本質樣片經25 g/L TPP溶液浸泡2 h)以及CPP-ACP在TPP輔助下再礦化21 d的脫礦牙本質樣片進行官能團分析，設定的ATR-FTIR工作參數如下：分辨率4 cm-1，掃描范圍700～4 000 cm-1，掃描次數32次。

1.2.4牙本質樣片的微觀形態觀察 處理21 d后的5組牙本質樣片經干燥、噴金后分別置于掃描電鏡(SEM)下觀察表面微觀形態變化情況。A、B組牙本質樣片經脫水、包埋、切片后于透射電鏡(TEM)下進行觀察，評價標準為牙本質膠原纖維是否出現周期樣“橫紋”的典型纖維內再礦化結構。

1.2.5牙本質樣片鈣/磷元素摩爾比的檢測 處理21 d后的5組牙本質樣片，每組各取1個樣片于其表面隨機選取5個點，通過X射線能譜分析(EDS)檢測羥基磷灰石主要成分鈣/磷元素摩爾比。采用SPSS 17.0統計軟件進行統計處理，所得數據進行單因素方差分析，以P<0.05為有統計學差異。

2 結 果

2.1 牙本質樣片表面官能團檢測分析結果

曲線1代表天然牙本質樣片；曲線2代表脫礦牙本質樣片；曲線3代表TPP處理的脫礦牙本質樣片；曲線4代表CPP-ACP在TPP輔助再礦化21 d后的脫礦牙本質樣片

2.2 牙本質樣片表面形貌SEM下觀察結果

SEM下觀察可見，E組牙本質小管大部分處于封閉狀態；D組牙本質樣片完成了脫礦，牙本質小管基本處于開放狀態；A組牙本質樣片表面有較多礦化物沉積，部分牙本質小管完成了封閉，但表面礦化物的沉積不均勻；B組在脫礦牙本質樣片表面均勻沉積大量再礦化物，牙本質小管基本完成了封閉；C組在脫礦牙本質樣片表面只見少量再礦化物沉積，幾乎未見有牙本質小管封閉(圖2)。

A～E分別為A～E組，1 000倍

2.3 牙本質樣片的TEM下觀察結果

TEM下觀察結果顯示，A組樣本牙本質膠原纖維內幾乎未見周期樣“橫紋”結構，B組樣本牙本質膠原纖維內可見周期樣“橫紋”結構，纖維內有晶體物質形成(圖3)。

A、B分別為A、B組，B組中白色箭頭所指為出現的周期樣“橫紋”結構，30 000倍

2.4 牙本質樣片鈣/磷元素摩爾比檢測結果

EDS檢測結果顯示，A～E組樣本鈣/磷元素摩爾比分別為1.57±0.03、1.62±0.03、1.51±0.03、1.48±0.05、1.65±0.04，其中B組鈣/磷元素摩爾比顯著高于A、C及D組(F=19.27，P<0.05)；B組與E組比較差異無顯著性(P>0.05)。

3 討 論

CPP-ACP作為一種生物相容性較好的仿生分子以往常用在牙釉質的再礦化中，并取得了一定的成效，但在牙本質的再礦化中應用較少，這主要是牙本質結構的復雜性決定了CPP-ACP作用于牙本質再礦化的難度要高于在牙釉質中的再礦化[16-17]。牙釉質90%以上是由羥基磷灰石等無機物構成，只有極少量的有機成分，這種結構特征便于CPP-ACP以鈣、磷酸根離子為原料在脫礦的牙釉質表面以殘存磷灰石為模板完成晶胞的生長和復制[18-20]。牙本質結構的復雜性要遠遠高于牙釉質，除了無機成分，還具有大量的有機成分，其中主要是膠原纖維和非膠原蛋白。在天然牙本質再礦化中，再礦化過程不是簡單的礦化離子的生長沉積，而主要是依靠非膠原蛋白調控鈣、磷酸根離子等以牙本質膠原纖維為模板完成有序排列的過程[21-22]。本研究即是通過仿生再礦化來模擬生物自然的再礦化過程。

單獨使用CPP-ACP很難完成這種生物的自然礦化，CPP-ACP可以穩定鈣、磷酸根離子在過飽和濃度進入脫礦區，但很難真正進入到牙本質膠原纖維內。要實現牙本質的仿生再礦化，不僅要完成礦化物在膠原纖維表面的沉積，同時礦化物要能進入到膠原纖維內部，完成纖維內的再礦化[23-25]。TPP作為一種線狀聚磷酸鹽同樣可作為仿生分子，TPP可以磷酸化牙本質膠原纖維，并且標記膠原纖維的成核位點，即模擬了牙本質非膠原蛋白的N端功能團[26-27]。在本研究中，首先通過TPP溶液磷酸化脫礦牙本質的膠原纖維，以膠原纖維作為礦化模板并在膠原纖維上標記再礦化的成核位點，然后通過CPP-ACP穩定和運輸礦化原料到標記好的成核位點上，從而模擬自然礦化過程中晶體的自組裝和排列過程完成再礦化。

本研究分別從牙本質樣片表面官能團變化、表面微觀形態變化、內部結構改變以及礦化后鈣/磷元素成分變化等多方面綜合分析了CPP-ACP在TPP協同作用下對脫礦牙本質的再礦化效果。結果顯示CPP-ACP和TPP兩種仿生分子最大限度地模擬了牙本質的自然再礦化過程，同時實現了牙本質的纖維內和纖維外的再礦化，此礦化方法可作為脫礦牙本質的一種精準、有效的仿生再礦化方法。