吲哚箐綠衍生物結合熒光腹腔鏡定量探測系統在胃腸腫瘤顯像中的應用

鄭曉明 ， 劉瓊 ， 邵軍 ， 王娟麗 ， 朱凝 ， 趙靈智 ， 魏波 *

（1 中山大學附屬第三醫院， 廣東 廣州 510630； 2 華南師范大學 半導體科學與技術研究院， 廣東 廣州 510631）

胃癌、 結直腸癌均是我國常見的惡性腫瘤， 每年新發病例數超過100 萬， 且超過80%的病例已是中晚期， 每年死亡病例高達 70 萬［1-2］， 因此胃癌、 結直腸癌的診斷和治療已成為亟待解決的問題。 1987 年， 法國醫師Philippe M 完成了世界上首例腹腔鏡膽囊切除術， 標志著微創手術時代的到來［3］。 多項相關研究［4-6］表明， 腹腔鏡手術在胃癌和結直腸癌患者預后及生存率方面與開放手術沒有顯著差異。 然而， 腹腔鏡手術由于缺少外科醫師的觸感， 對于腫瘤及相關淋巴結的定位不及開放性手術。 近年來， 近紅外熒光腹腔鏡及吲哚菁綠 （indocyanine green，ICG） 正逐漸應用于臨床［7-8］， 可解決腹腔鏡對于腫瘤及相關淋巴結定位不夠準確的問題。 本研究就此建立動物腫瘤模型，使用自主搭建的腹腔鏡系統對小鼠皮下腫瘤注射ICG 及其納米衍生物進行驗證， 探討熒光顯像的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗對象動物造模： SPF 級 6 ～ 8 周齡的雌性 BALB／c 裸鼠若干， 體重 18 ～ 22 g， 自由進食飲水。 籠具、 墊料、 飼料和水均經高壓蒸汽滅菌， 并適時更換。 體外培養Hct116 腫瘤細胞系至對數期， 制成濃度約 2 × 107個 ／mL 細胞懸液， 取 0.2 mL （4 × 106個） 注入裸鼠右側腋下， 常規飼養， 每天固定時間游標卡尺測量腫瘤生長， 體積計算公式： 體積 （mm3） ＝ 0.5× 長度 × 寬2。 當皮下腫瘤長至約 1 000 mm3時， 造模完成。

1.2 設備自主搭建熒光腹腔鏡系統 （圖1）， 該熒光內鏡及光譜檢測分析系統主要包含： ①光源； ②光信號的采集器件及濾鏡； ③相機 （CCD）； ④用于光譜采集與分析的光纖、 光譜儀；⑤計算、 輸入及輸出等的硬件系統； ⑥各模塊控制、 信息獲取及圖像呈現的軟件系統。

圖1 熒光腹腔鏡系統

1.3 實驗方法①設置熒光腹腔鏡參數： 參考ICG 溶液在該熒光腹腔鏡下的顯像效果， 設置785 nm 近紅外光源與普通白光，調試腹腔鏡工作距離與焦距， 并固定腹腔鏡與動物操作臺之間的距離。 ②取模型小鼠 12 只， 隨機分為 3 組， 每組 4 只， 戊巴比妥鈉麻醉后， 分別尾靜脈注射 PBS 0.1 mL， 濃度 600 μg／mL的 ICG 溶液 0.1 mL 及相同當量的 ICG 納米衍生物溶液 0.1 mL。注射后1、 2、 6 h 在熒光腹腔鏡下的動物操作臺下觀察皮下瘤熒光顯像狀態， 拍照記錄。 ③電腦軟件及光譜儀分析： 取光譜儀在近紅外光源下對小鼠皮下瘤位置處進行光譜分析并記錄。

2 結果

2.1 模型小鼠皮下瘤熒光腹腔鏡顯像比較不同組小鼠在分別注射PBS、 ICG 及ICG 納米衍生物后， 在皮下瘤處于與熒光腹腔鏡相同位置的情況下， 熒光顯像顯著不同， 其中ICG 組及ICG 納米衍生物組明顯可見皮下瘤處熒光顯像， PBS 組未見熒光顯像。 2 h 時， ICG 納米衍生物組較ICG 組熒光強度稍強。 6 h 時， ICG 組在皮下瘤處熒光基本消失， 而ICG 納米衍生物組仍具有一定熒光強度 （圖2a）。

2.2 模型小鼠皮下瘤光譜儀分析比較熒光腹腔鏡軟件分析，ICG 組和ICG 納米衍生物組小鼠腫瘤處平均熒光強度顯著高于PBS 組， 且每個時間點ICG 納米衍生物組的平均熒光強度均較ICG 組強， ICG 組皮下瘤熒光在 6 h 后基本消失， 而 ICG 納米衍生物組仍存在 （圖 2b）。 經光譜儀分析， ICG 組和 ICG 納米衍生物組小鼠在810 ～820 nm 可見典型透過率曲線 （圖2c）。

圖2 模型小鼠熒光腹腔鏡顯像情況

3 討論

ICG 是美國FDA 唯一允許的、 可安全應用于臨床的熒光顯像劑， 具有低敏、 安全、 反應快的特點［9］， 它的面世使得包括肝癌、 胃腸癌等的熒光腹腔鏡手術成為可能。 不同于其他顯像劑， 如納米碳、 美蘭等［10-11］， 低濃度 ICG 溶液在普通白光下呈淡綠色， 而術者可自由切換腹腔鏡的熒光模式和可見光模式， 在可見光模式下， 不會出現污染正常術野的情況， ICG 由肝代謝并經膽道排出， 半衰期 3 ～4 min， 不會滯留體內， 故ICG 不會出現腹腔內溢出或者長時間無法代謝等問題。

雖然ICG 的應用前景巨大， 但ICG 亦存在高水解性、 快速血漿清除率和無相關特異性的缺點［12］， ICG 納米衍生物可較好地提高藥物的生物利用度， 改善穩定性［13］。 生物納米材料能較好地包裹ICG， 避免ICG 快速地被血清蛋白結合而代謝。 再者， 納米材料在腫瘤中的應用， 能提高ICG 的生物利用度， 并增強其滲透性和保留效應， 即納米材料的被動靶向作用， 納米材料能被動地在腫瘤組織中富集， 從而提高了ICG 的生物利用度和一定的靶向性。

本研究通過構建人Hct116 腫瘤細胞系裸鼠皮下瘤小鼠模型， 隨機分組后， 分別于小鼠尾靜脈注射相同體積的 PBS 溶液、 60 μg ICG 溶液和與 ICG 相同當量的 ICG 納米衍生物， 并使用自主搭建的熒光腹腔鏡系統進行圖像與光譜分析， 結果顯示， ICG 組與ICG 納米衍生物組小鼠皮下瘤熒光顯像明顯， 均可見ICG 特征的熒光光譜圖像， 而PBS 組無明顯熒光。 通過軟件分析腫瘤處平均熒光強度， 1 h 時， ICG 納米衍生物組較ICG組熒光稍強； 而 2 h 時， 兩組的差異較為顯著； 6 h 時， ICG 組熒光基本消失， 而ICG 納米衍生物組仍具有一定強度的熒光，光譜儀顯示模型小鼠皮下瘤處存在典型的ICG 激發光。 該結果表明使用熒光腹腔鏡在ICG 及ICG 納米衍生物等顯像劑的幫助下有利于辨別腫瘤與正常組織， 且ICG 納米衍生物可改善ICG熒光顯像的穩定性與生物利用度。 ICG 的具體注射方法及其納米衍生物療效值得進一步研究。