冷凍電鏡技術在結構生物學中的研究現狀及展望

摘 要：冷凍電鏡技術近年來獲得了迅猛的發展，取得了許多具有重大意義的成果。冷凍電鏡將生物分子進行冷凍便可進行高分辨率成像，還具有分辨率高、更接近天然狀態、適用研究對象廣泛等優勢。同時，系統地綜述了冷凍電鏡技術在科學研究中的應用，并展望冷凍電鏡技術未來的發展。

關鍵詞：冷凍電鏡;結構生物學

中圖分類號：TG115.21+5.3;Q518.3 ?文獻標志碼：A

Abstract Cryo-electron microscopy technology has made rapid development in recent years，and many groundbreaking results has achieved. Cryo-electron microscopy can freeze biomolecules for high-resolution imaging. It also has the advantages of high resolution，closer to the natural state，and a wide range of research objects. At the same time，the application of cryo-electron microscopy technology in scientific research is systematically reviewed and the future development is prospected.

Key words Cryo-electron microscopy;structural biology

冷凍電鏡（cryo-electron microscopy，cryo-EM）技術，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術，即把樣品冷凍并保持低溫放進顯微鏡里面，用高度相干的電子作為光源從上面照射，透過樣品和附近的冰層，受到散射，再利用探測器和透鏡系統把散射信號成像記錄下來，最后進行信號處理，得到樣品的結構[1]。冷凍電鏡技術作為一種重要的結構生物學研究方法，它與X射線晶體學、核磁共振一起構成了結構生物學研究的基礎。[1]

1 冷凍電鏡技術的基本原理

1.1 電鏡三維重構理論

D.DeRosier和A.Klug提出三維重構理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來重構被測物體的立體構型，利用計算機數字圖像處理技術進行電子顯微像三維重構測定生物大分子結構的概念和方法[2]。

透射電子顯微鏡成像過程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。運用中心截面定理，從而可以通過三維物體不同角度的二維投影在計算機內進行三維重構來解析獲得物體的三維結構。

1.2 三維冷凍電鏡技術

樣品經過在液氮中的冷凍固定，使得生物大分子中的H2O分子以玻璃態的形式存在，保持低溫，將樣品放入顯微鏡，高度相干的電子作為光源從上面照射下來，透過樣品和附近的冰層，受到散射，利用探測器和透鏡系統把散射的信號成像記錄下來，再進行信號處理，最后利用三維重構的技術得到樣品的三維結構。

2 冷凍電鏡技術的獨特優勢

2.1 分辨率高

光學顯微鏡的分辨率為0.2μm，透射電子顯微鏡的分辨率為0.2nm，透射電子顯微鏡在光學顯微鏡的基礎上放大了1000倍。

2.2 更接近天然狀態

電子斷層成像技術則可用來研究一定厚度的亞細胞器在天然狀態下的內部結構，不需要蛋白質結晶[3]。

2.3 適用研究對象廣泛

冷凍電鏡單粒子法既可以對具有對稱結構的大分子進行研究，也適合于研究結構不規則的大分子復合物，對于分子量的上限沒有限制，理論上>100kD的分子在成像技術能夠保證的情況下可以形成足夠的對比以進行圖像校正。

3 冷凍電鏡技術在結構生物學中的應用

冷凍電鏡技術主要應用在單個蛋白質分子結構的分析方面。此外，冷凍電子顯微鏡技術還將廣泛應用于細胞組織的超微結構解析，對解開生命活動的規律和機制等奧秘會產生更大影響。清華大學生命科學學院王宏偉團隊創造了利用冷凍電鏡單顆粒分析技術解析至近原子分辨率的分子量最小的生物大分子的記錄[4]。施一公研究組解析了γ-secretase蛋白質和RyR-1蛋白質[5]。楊茂君研究組解析了Mammalian respirasome蛋白質[6]。隨著越來越多蛋白質神秘面紗的揭開，我們可以更好地解釋各種各樣的生命活動發生的原因和機理。利用冷凍電鏡技術觀察到的蛋白質結構，我們可以定向改造或構建新的蛋白質用于科研或醫療領域。

4 總結與展望

冷凍電鏡技術具有分辨率高、更接近天然狀態、適用研究對象廣泛等特點，越來越多的科學家開始把冷凍電鏡技術作為研究的一個新方向。冷凍電鏡技術與X射線技術和核磁共振技術互相補充，讓絕大多數的蛋白質的結構都可以被解析。眾多領域的研究者們將在未來冷凍電鏡新的技術方法的開發中發揮重要的作用，成為該技術的進一步完善與成熟的重要力量。冷凍電鏡領域研究者們則需要以主動開放的態度吸引其他領域研究者的合作，并積極迎接來自更多領域研究者的挑戰，保持并發展自己的技術特長，站在技術發展的制高點上選準研究方向，始終在冷凍電鏡的技術前沿上開疆拓土。

參考文獻

[1] 王宏偉. 冷凍電子顯微學在結構生物學研究中的現狀與展望 [J]. 中國科學：生命科學，2014，44（10）：1020-1028.

[2] 程凌鵬. 生物大分子高分辨率冷凍電鏡三維重構技術 [J]. 實驗技術與管理，2018，35（06）：17-22+26.

[3] MAOFU L，ERHU C，DAVID J，et al. Structure of the TRPV1 channel determined by electron cryo-microscopy [J]. Nature：International weekly journal of science，2013，504（7478）：107-112.

[4] 馨婭. 利用冷凍電鏡方法成功解析最小分子量的蛋白質 [J]. 科學，2019，71（04）：62.

[5] BAI S S，ZHUO L，SUN Y，et al. Physalin B reduce secretion of Aβ by inhibiting phosphorylation of STAT3 via down-regulated expression of β-secretase and γ-secretase [J]. 中國藥理學與毒理學雜志，2019，33（06）：426-427.

[6] GU J，WU M，GUO R Y，et al. The architecture of the mammalian respirasome [J]. Nature，2016，537（7622）.

作者簡介：陳薇，女，1999年出生，本科，生物技術。