哮喘小鼠CCR4/TARC信號軸對Treg/Th17細胞平衡的調控研究

劉彤 銀維謀 藍嬌 龍勝澤 覃松梅 韋彩周 韋碧妙李鳳獻 羅凌 覃雪軍

1廣西壯族自治區人民醫院呼吸與危重癥醫學科（南寧530021）；2廣西柳州市人民醫院呼吸與危重癥醫學科（廣西柳州545006）

支氣管哮喘是一種病因復雜的慢性非特異性炎癥。淋巴細胞介導的免疫失衡在支氣管哮喘的發病中擔任著重要角色。既往研究提示，支氣管哮喘發病除了受輔助性T 細胞1（T helper cell 1，Th1）/輔助性T 細胞2（T helper cell 2，Th2）失衡影響外，還與調節性T 淋巴細胞（regulatory T cells，Treg）/輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17）細胞的失衡有關［1-2］。但是，目前對于Treg/Th17細胞免疫失衡在哮喘中的作用機制尚不明確。CCR4/TARC信號軸在腫瘤細胞轉移、胸腔積液患者Foxp3+Treg向胸腔募集等均起到調控作用［3］。而Treg 和Th17表面 均 存在CCR4 表 達，TARC 又 是CCR4 的特 異性配體之一［4］。在支氣管哮喘中，CCR4/TARC 信號軸是否參與了Treg/Th17 細胞平衡的調控對于加深對支氣管哮喘發病機制的了解有著重要意義。為了進一步明確CCR4/TARC 信號軸、Treg/Th17 細胞平衡與支氣管哮喘炎癥之間關聯，本研究通過建立哮喘小鼠模型對此進行探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇廣西醫科大學動物實驗中心的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級BALB/C 雌性小鼠20 只作為研究對象。納入標準：所有小鼠均被飼養在SPF 級實驗小鼠實驗室，其喂養飼料均接受過無菌處理，且飼料成分中不含卵清蛋白（ovablumin，OVA）。按簡單隨機分組法，20 只雌性BALB/C 小鼠分為哮喘組10 只（1 只小鼠因出現呼吸抑制死亡）和對照組（10 只），分籠飼養。兩組小鼠的周齡均為6～7 周，體重18～22 g，比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠致敏于實驗開始的第0 天、第7 天及第14 天分別進行3 次致敏，方法如下：給每只哮喘組小鼠進行局部皮膚碘伏消毒，然后腹腔注射OVA 致敏混懸液0.2 mL，其中包含有OVA 25 μg 和氫氧化鋁凝膠0.1 mL。對照組小鼠則注射同等劑量的1×PBS。

1.2.2 小鼠激發從實驗第21 天開始進行小鼠激發，每天1 次，連續7 d。方法如下：首先應用碘伏對哮喘組小鼠進行局部皮膚消毒，然后自腹腔向小鼠注射1%戊巴比妥鈉混合液完成麻醉，注射劑量為45 mg/kg，再用OVA 溶液40 μL 進行滴鼻。對照組則進行同等量1×PBS 滴鼻。

1.2.3 樣本采集兩組小鼠均在最后1 次激發后處死，然后采集小鼠外周血、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），進行離心分離進行ELISA 檢測，并分離肺組織，提取淋巴細胞進行測定。

1.3 觀察指標（1）比較兩組小鼠肺組織病理學改變。（2）比較兩組小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴細胞的占比、CCR4 在Treg 和Th17 中的表達水平。（3）比較兩組小鼠BALF 中白細胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）和TARC 濃度。（4）分析肺組織炎癥評分與BALF 中TARC 的相關性及哮喘組肺內Th17 細胞的比例變化與BALF 中TARC 濃度的相關性。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0 進行統計學分析，計量數據以均數±標準差表示，采用F檢驗，計數資料采用Mann-WhitneyU檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學改變 哮喘組小鼠支氣管黏膜、基底膜、肺間質和肺泡壁均增厚，部分肺泡結構破壞，支氣管及血管周圍出現明顯炎性細胞浸潤，對照組無此改變。

2.2 兩組小鼠支氣管及其周圍炎癥細胞浸潤評分比較哮喘組炎癥細胞浸潤評分顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組小鼠支氣管及其周圍炎癥細胞浸潤評分比較Tab.1 Comparison of inflammatory cell infiltration scores in bronchus and surrounding areas between the two groups 例（%）

2.3 兩組小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴細胞的占比比較哮喘組小鼠肺內、外周血中的Treg 細胞在CD4+T 淋巴細胞占比低于對照組，哮喘組小鼠肺內、外周血Th17 細胞在CD4+T 淋巴細胞的在高于對照組，哮喘組肺內、外周血中的Treg/Th17細胞比值顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、3。

表2 肺組織淋巴細胞Treg、Thl7 百分比檢測結果Tab.2 Detection results of Treg and Thl7 percentages of lymphocytes in lung tissue ±s

表2 肺組織淋巴細胞Treg、Thl7 百分比檢測結果Tab.2 Detection results of Treg and Thl7 percentages of lymphocytes in lung tissue ±s

組別哮喘組對照組t 值P 值例數9 10 CD4+CD25+Foxp3+T 細胞（%）4.54±2.68 11.54±1.8 1.550＜0.001 CD4+IL-17+T 細胞（%）2.58±0.43 0.76±0.15 7.873＜0.001 Treg/th17 細胞1.88±1.31 15.35±2.30 4.178＜0.001

表3 外周血淋巴細胞Treg、Thl7 百分比檢測結果Tab.3 Detection results of Treg and Thl7 percentages of peripheral blood lymphocytes ±s

表3 外周血淋巴細胞Treg、Thl7 百分比檢測結果Tab.3 Detection results of Treg and Thl7 percentages of peripheral blood lymphocytes ±s

組別哮喘組對照組t 值P 值例數9 10 CD4+CD25+Foxp3+ T 細胞（%）3.73±0.58 10.05±2.43 2.294＜0.001 CD4+IL-17+T 細胞（%）2.12±0.69 0.93±0.41 3.009 0.001 Treg/th17 細胞1.95±1.34 13.43±7.65 14.530＜0.001

2.4 兩組小鼠CCR4 在Treg 細胞和Th17 細胞中的表達比較哮喘組肺內、外周血中的CCR4 在Treg、Th17 細胞中的表達與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 CCR4 表達Fig.1 Expression results of CCR4

2.5 兩組小鼠血清和BALF 中IL-17A和TARC 濃度比較兩組小鼠IL-17A 在血清和BALF 中的濃度均呈低水平，差異無統計學意義（P＞0.05）；兩組小鼠血清中TARC 的濃度均呈低水平，差異無統計學意義（P＞0.05）；哮喘組小鼠BALF 中TARC 的濃度高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4、5。

表4 兩組小鼠血清中和BALF 中IL-17A 的濃度Tab.4 Concentrations of IL-17A in serum and BALF of mice in two groups ±s

表4 兩組小鼠血清中和BALF 中IL-17A 的濃度Tab.4 Concentrations of IL-17A in serum and BALF of mice in two groups ±s

組別哮喘組對照組t 值P 值例數9 10血清中IL-17A的濃度（pg/mL）7.19±0.01 7.20±0.03 0.994 0.796 BALF 中IL-17A的濃度（pg/mL）7.46±0.43 7.24±0.07 1.516 0.934

表5 兩組小鼠血清中和BALF 中TARC 的濃度Tab.5 Concentration of TARC in serum and BALF of two groups of mice ±s

表5 兩組小鼠血清中和BALF 中TARC 的濃度Tab.5 Concentration of TARC in serum and BALF of two groups of mice ±s

組別哮喘組對照組t 值P 值例數9 10血清中TARC的濃度（pg/mL）21.96±6.44 22.15±4.54 0.073 0.713 BALF 中TARC的濃度（pg/mL）108.27±62.16 41.07±18.95 2.137 0.006

2.6 哮喘組肺內炎癥細胞浸潤評分與BALF 內TARC 濃度的相關性哮喘組肺內炎癥細胞浸潤評分與BALF 內TARC 濃度呈正相關（r=0.673，P＜0.05）。

2.7 哮喘組肺內Th17細胞與BALF內TARC濃度的相關性分析哮喘組肺內Th17 細胞與BALF 內TARC 濃度呈正相關（r=0.586，P＜0.05）。

3 討論

既往研究認為，支氣管哮喘的發病主要是因Th1/Th2細胞比例失衡所致［5-6］。近年來的研究發現，Treg 數目變化或功能缺陷與支氣管哮喘氣道炎癥有關，而Treg 細胞與Th17 細胞的關系密切［7-9］。Th17/Treg 細胞比例失衡與哮喘的炎癥反應的相關性已被研究證實，但其具體作用機制以及受何種因素影響尚不清楚。明確Treg/Th17 細胞失衡的作用機制以及其所受調控因素對支氣管哮喘的診療有著重要意義。

Treg 特異性表達CD25 及其轉錄因子Foxp3 能夠介導機體免疫功能，抑制CD4+CD25-T 淋巴細胞的表達，還能對Th1 與Th2 細胞產生抑制作用，影響T 淋巴細胞的分化。既往動物實驗顯示，Treg能夠通過介導Th2 細胞減輕氣道對過敏原的反應，進而緩解哮喘氣道炎癥［10-11］。Th17細胞會產生IL-17A 等細胞因子，而其分化又受到TGF-β、IL-6、IL-23 等因子調節。TGF-β和視黃酸呈高表達會促進Treg 的分化，TGF-β、IL-6 及IL-1β呈低表達則會對Th17 的分化起到促進作用［12］。由此可知，Treg與Th17 細胞在功能方面具有拮抗作用，通常情況下二者保持著一定的平衡，維持著機體功能正常作用。但一旦這種平衡被破壞，則會導致機體免疫受損，引發免疫相關疾病［13-14］。本研究通過流式細胞術對哮喘小鼠模型肺內和外周血中的Treg、Th17 細胞在CD4+T 淋巴細胞中所占比例進行檢測發現：哮喘小鼠的Treg 無論是在肺內還是在外周血中的濃度比無哮喘小鼠均更低，而肺內和外周血的Th17 細胞濃度較無哮喘小鼠則明顯更高；哮喘小鼠在肺內和外周血中的Treg/Th17 細胞比值與無哮喘小鼠比較則出現明顯下降。在機體自身狀態穩定、無損傷時，免疫系統的TGF-β始終處于低水平。少量的TGF-β可誘導初始T 細胞分化出Treg 細胞，Treg/Th17 細胞比值處于平衡狀態。TGF-β水平較低時，其分化作用也相對較弱。但在機體有炎癥損傷的情況下，免疫系統則釋放出大量TGF-β、IL-6 等細胞因子，導致Th17 細胞分化作用大幅增強，導致Th17 濃度上升，打破Treg和Th17 平衡，引發Treg/Th17 細胞比值變化。由此可見，哮喘氣道炎癥與Treg/Th17 細胞比值在肺內和外周血中的失衡有密切關聯，與既往研究一致［11-13］。

Treg 和Th17 表面都存在CCR4 表達，TARC 又是CCR4 的特異性配體。已有研究表明，處于急性期的哮喘兒童TARC 水平異常升高［15-17］。因此推測CCR4/TARC信號軸也可能對Treg與Th17 之間平衡產生影響，進而影響炎癥發展。已有多項研究明確了CCR4/TARC 信號軸可在多種疾病中發揮調控作用，如Foxp3+Treg 向胸腔募集、腫瘤細胞轉移等［18-20］。因此，CCR4/TARC 信號軸也可能通過調控Treg/Th17 細胞平衡而促進炎癥向肺內的浸潤。本研究中，Treg 和Th17 細胞在哮喘組和正常小鼠的CCR4 中的表達水平均較高，且二者之間差異無統計學意義，由此提示CCR4/TARC 信號軸可對Treg 和Th17 細胞發揮調控作用，且調控效能無差異。IL-17A 在Th17 細胞中發揮著主要作用［21］。但本研究發現，哮喘小鼠和正常小鼠IL-17A 在血清和BALF 中均呈低水平，且比較差異無統計學意義。對此，推測原因可能是因為Th17 細胞比例雖增加但并未被激活，因此未起到介導炎癥的作用。而且Th17 在急性哮喘中并非通過IL-17A 介導炎癥反應，而是以IL-17F、IL-22 為主［22］。通過TARC的濃度檢測發現，兩組小鼠血清中TARC 呈低水平，而在哮喘組BALF 中TARC 的濃度要高于正常小鼠，且兩組小鼠TARC 在BALF 內的水平較血清中明顯更高。分析認為，這可能是因為小鼠氣道上皮細胞產生的TARC 導致了其在BALF內的水平上升，也可能是氣道內其他炎癥細胞產生的TARC 導致了其水平升高。通過相關性分析發現，肺組織肺內炎癥細胞浸潤評分越高，BALF內TARC濃度也越高，二者呈正相關；而且哮喘組肺內Th17細胞的比例變化與BALF 內TARC 的濃度變化呈正相關。由此得出，哮喘小鼠CCR4/TARC 信號軸通過調控Th17 細胞向肺組織的浸潤。

綜上所述，Treg/Th17 細胞比值變化與哮喘肺內炎癥的發生、發展有密切相關，而CCR4/TARC信號軸可能通過對Th17 的調控參與炎癥向肺內的浸潤。