長期吸入低濃度七氟烷對雌性小鼠早期胚胎及妊娠結果的影響

舒蕤 張成明 丁國建

濱州醫學院附屬醫院1麻醉科，2小兒外科（山東濱州256603）；3濰坊醫學院麻醉學系（山東濰坊261053）

吸入麻醉藥自應用于臨床以來，手術室吸入麻醉藥廢氣污染的問題就一直受到高度關注。七氟烷是近年來臨床中最常用的吸入麻醉藥［1］，同時也是手術中主要的麻醉廢氣之一，麻醉醫師及護理人員長期暴露于低濃度七氟烷環境中。大量的流行病學研究資料表明，長期處于麻醉廢氣環境中的女性自然流產率和畸胎出生率都明顯高于正常環境中的女性［2-3］。目前已有很多關于七氟烷器官毒性［4］和對學習記憶的影響［5］等方面研究，近年來也出現關于胚胎期母體暴露于七氟烷的相關研究，結果表明在胚胎發育時可對其神經系統［6-9］、聽力［10］、學習及記憶力［11］等產生不良影響。長期暴露于低濃度七氟烷是否會降低卵子的質量，影響卵子受精、卵裂和胚胎著床等尚不明確。因此，本研究模擬長期暴露于七氟烷廢氣的工作環境，通過觀察低濃度七氟烷對小鼠早期胚胎及妊娠結果的影響，探討低濃度七氟烷對雌性小鼠生殖生理的影響，擬為臨床安全用藥、職業防護提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑6周齡SPF級雌性健康昆明小鼠，體質量（20±2）g（由山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物室提供，動物許可證號：SCXK魯20080002）；小鼠分籠飼養1 周以適應環境，觀察各組動物進食、活動、糞便、毛發等情況。飼養環境通風清潔，溫度21～25 ℃，相對濕度45%～55%，明暗周期為12 h/12 h（8：00 開燈，20：00 關燈）。供給充足的飲水和全營養飼料。七氟烷購自上海恒瑞醫藥有限公司（產品批號：10122132）。本研究通過本院倫理委員會批準（審批號：20190125-02）。

1.2 實驗方法6 周齡昆明雌性小鼠24 只，隨機分為七氟醚組（A 組）和對照組（B 組）兩組。性成熟雄性小鼠12 只，注意體質量均勻、單獨飼養，實驗前雄性小鼠長期禁欲。A 組每天持續吸入0.1%七氟烷6 h，B 組正常飼養。雄性小鼠正常飼養。30 d 后取發情期雌鼠與性成熟雄鼠2∶1 合籠，合籠第二日晨7 時觀察雌鼠陰栓以確定是否受孕，發現陰栓者記為孕0.5 d。A、B 兩組受孕小鼠再分別隨機分為A1、A2、B1、B2 四個組。各組雌鼠維持原條件飼養。A1、B1 組分別在受孕小鼠孕3.5 d 時將其頸椎脫臼處死，用75%酒精噴灑小鼠，消毒后放置于實驗臺上，使用潔凈紗布輕拭小鼠腹部，并用兩只止血鉗將腹部皮膚稍提起，向頭尾兩側將其皮膚撕開，至一側將其頭包裹，一側將其后肢包裹。左手使用鑷子將腹膜提起，右手持剪刀剪開腹膜，使其平攤于解剖板上，將腸道翻向一側腹膜，暴露一側腎臟，在腎臟下方可以看到連有脂肪組織的該側卵巢。夾住卵巢旁的脂肪將其輕輕提起，并鈍性游離子宮，并取出子宮，用注射器將子宮內桑葚胚或囊胚階段的胚胎沖出收集，倒置顯微鏡下觀察形態。A2 和B2 組受孕小鼠孕18.5 d 時脫臼處死，取出含有胚胎的子宮，顯微器械剖開子宮，進行子宮及胚胎的觀察。在飼養過程中，同時觀察受孕小鼠有無流產現象及其他異常。

1.3 監測指標A1 和B1 組孕早期桑甚胚或囊胚階段胚胎的收集及鏡檢。A2 和B2 組檢查胎鼠的體質量和身長。孕期雌性小鼠流產狀況。

1.4 統計學方法所有數據使用SPSS 17.0 統計軟件進行數據統計，符合正態分布計量數據用均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 假孕現象A 組中2 只小鼠出現假孕現象（陰道內見陰栓，但解剖后未發現胚胎），B 組出現1 只。見圖1。

圖1 小鼠陰栓如圖所示Fig.1 The vaginal plug of females

2.2 異常胚胎A 組1 只小鼠孕3.5 d 解剖發現子宮腫脹現象，且宮腔內未發現胚胎，B 組未發現此種現象；A 組孕3.5 d 出現異常胚胎，B 組未發現（圖2）。

2.3 陰道流血A 組2 只出現陰道流血現象，解剖發現子宮內含有暗紅色積血，B 組未發現。見圖3、4。

2.4 異常胎盤A 組1 只出現異常胎盤，B 組未發現異常胚胎。見圖5、6。

2.5 胚胎身長和體質量小鼠孕18.5 d 解剖得胚胎，A 組胚胎體質量低于B 組胚胎，差異有統計學意義（P＜0.05）；身長亦低于B 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組胎鼠身長體質量的比較Tab.1 Comparison of body length and weight of fetal rats in each group ±s

表1 各組胎鼠身長體質量的比較Tab.1 Comparison of body length and weight of fetal rats in each group ±s

注：A 組缺少數值者以本組平均值代替，A 組與B 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別/監測指標身長（cm）體質量（g）B 組2.97±0.55 1.72±0.60 A 組1.96±0.43△1.03±0.22△

圖2 A、B 兩組小鼠孕3.5 d 子宮腔內正常桑葚胚、正常囊胚、異常桑葚胚、異常胚胎Fig.2 Normal morula，normal blastocysts，abnormal morula and abnormal embryos in the uterine cavity of mice in two groups at 3.5 days of pregnancy

圖3 A 組小鼠出現陰道流血現象Fig.3 Vaginal bleeding of mice in group A

圖4 A 組陰道流血小鼠解剖發現子宮內暗紅色積血Fig.4 Dark red hematocele in uterus of vaginal bleeding mice in group A

圖6 A 組小鼠子宮腔內發現異常胎盤及暗綠色污物Fig.6 Abnormal placenta and dark green dirt were found in uterine cavity of mice in group A

3 討論

手術室工作環境中，由于麻醉技術或其他問題比如不適當的面罩、未充盈的氣管套囊或喉罩氣道袖口充氣不足等，都有可能導致手術室存在著低濃度殘余吸入麻醉藥，造成微量麻醉廢氣污染環境［12］。流行病學研究資料顯示，長期暴露于微量的麻醉廢氣污染環境的女性工作者，其自然流產、畸胎出生及生育能力下降發生的幾率都明顯高于不接觸吸入麻醉廢氣的婦女［13］。美國女麻醉師自然流產率達38%，而一般醫師為10%。英國、丹麥、芬蘭等國家亦發現女性麻醉醫師流產率增高［14］。近年來研究發現，長期暴露于超出標準麻醉廢氣濃度的工作人員可能出現遺傳學改變，長期吸入麻醉廢氣還可增加氧化應激、DNA 損傷［15］、染色體損傷［16］、基因毒性［13］以及腫瘤的發生。還有文獻［17］證明孕期接觸麻醉廢氣可能會對胎兒大腦產生負面影響，子代在學齡時期注意力不集中或多動癥的發生率增高。

由于各地手術室條件和通風設施不同，故文獻報道的各吸入麻醉廢氣濃度也不一致。在沒有麻醉廢氣處理設備的手術室進行吸入全麻，麻醉醫師工作區域七氟烷平均濃度可達0.001 2%［18］。即使在有廢氣處理設備的層流手術室內，七氟烷濃度也會在某時間段內升高，如在麻醉誘導期，空氣中七氟烷濃度可達0.001 7%［19］，且麻醉醫師工作區域七氟烷平均濃度高達0.004 6%，其濃度超過國際推薦值［20］。有研究表明，七氟烷可能誘導胚胎發育遲緩［21］、影響幼鼠的學習和記憶功能［22］。鼠類七氟烷MAC 為2.40%～2.50%，與人類相近，根據前期實驗研究結果［23］，本研究選取0.1%七氟烷模擬手術室廢氣環境，小鼠每天吸入6 h，連續吸30 d，大約相當于工作6～7年左右［24］。

胚胎植入前的子宮內膜處于分泌期，子宮內膜發生一系列形態及生理生化的改變，為胚泡著床做準備。母體雌激素和孕激素協同對胚胎的植入過程進行精細調節，子宮內膜對胚胎的接受能力稱之為子宮內膜容受性。胚泡著床又稱為植入，該過程包括胚泡在子宮內膜中的識別定位、黏附及入侵等，此過程是母體與胚胎相互作用的結果，是妊娠能否成功的關鍵。在小鼠等嚙齒類動物中，著床期發生在受精后4～5 d，大約持續24 h［25］。人類受精后受精卵約3～4 d進入子宮腔中，受精卵在宮腔內游離2～3 d 后，胚泡從透明帶中脫出，使表面滋養外胚層暴露在外，此時滋養外胚層向外伸展，對細胞外基質產生了粘附性。同時，圍繞在胚泡腔的壁滋養外胚層分化成為初生滋養層，侵入子宮基質層及血管基底膜中；而次生滋養層是由內細胞團相連的滋養外胚層分化成的，其向子宮蛻膜組織侵入，最終侵及至子宮內膜基底層和子宮內1/3的肌層，最終完成了胚胎種植的過程［26-27］。

本研究中，七氟烷組小鼠分別出現了假孕、子宮腫脹且宮腔內未發現胚胎、異常胚胎、陰道流血、異常胎盤等現象；孕18.5 d 解剖得胚胎，七氟烷組胚胎體質量、身長低于正常組胚胎。這些現象均表明長期吸入0.1%七氟烷導致子宮內膜容受性減小，干擾胚胎著床，增加流產幾率，影響受精卵向桑葚胚及囊胚的轉變，減緩胚胎的發育，影響雌性小鼠生殖功能。本研究模擬長期暴露于七氟烷麻醉廢氣環境，選取了0.1%七氟烷進行結果觀察，但吸入低于0.1%濃度的七氟烷是否也具有該影響未進行研究，且對其發生機制仍不清楚，仍需大量實驗進行下一步關于影響機制的研究，來證明長期暴露于七氟烷對手術室女性工作人員有無生殖功能的影響。