miR-149通過BMP/Smad信號通路對舌鱗狀細胞癌細胞增殖侵襲的影響

李京洋 保森竹 姚毅章 黃文泉

1青海省第五人民醫院/青海省腫瘤醫院（西寧810000）；2青海大學附屬醫院（西寧810000）；3江西中醫藥大學附屬醫院（南昌330006）

舌鱗狀細胞癌（TSCC）是一種以上皮來源為主的中分化鱗癌或高分化鱗癌，是最常見的口腔惡性腫瘤［1］。TSCC 的臨床表現主要為語音、咀嚼和吞咽方面的功能障礙，疾病后期往往發生局部或區域性復發和頸部淋巴結轉移［2］。針對TSCC，目前尚無特效治療方法，主要以單純手術治療、放射治療、全身化療和靶向治療為主要方向［3-4］。miR-149 以其廣泛參與生物學調控、在各種腫瘤中表達均異常等特點已然成為現代醫學研究的新方向和新思路。但是目前關于miR-149 的報道主要集中在膀胱癌、食管癌和骨肉瘤細胞等方面，對于miR-149 對舌鱗狀細胞癌細胞的影響和機制方面缺乏系統報道［5-8］。本研究旨在探討miR-149通過BMP/Smad 信號通路對TSCC 細胞增殖侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料人舌鱗癌細胞Tca8113（Procell，CL-0230）、人舌鱗癌細胞CAL-27（Procell，CL-0265）。

1.2 主要儀器和試劑miR-149 qRT-PCR 試劑盒（TransScript，AQ202-01）、細胞增殖檢測試劑盒（聯科生物，CP001）、BMP-2 抗體（BioVision，5672-100）、Anti-SMAD1/3/5 抗體（abcam，ab118825）、Anti-SMAD1/5/8/9 抗體（子起生物，PA141079）、細胞培養箱（力康）、PCR 儀（Thermo）等。

1.3 實驗方法采用熒光定量PCR 實驗測定miR-149 在舌鱗狀細胞癌細胞（Tca8113 和CAL-27）中的mRNA 表達，miR-149 的引物設計如表1所示［9］。采用瞬時轉染法將質粒在細胞融合度達到75%時轉入Tca8113 和CAL-27 細胞，分別分為miR-149-con 組和miR-149-mim 組（20 pmol Con-mimic/miR-149-mimic 質粒+Lipofectamine 1 μL）［10］，采用MTT法檢測miR-149 過表達對Tca8113 和CAL-27 細胞增殖的影響；采用Transwell 細胞侵襲實驗檢測miR-149 過表達對Tca8113 和CAL-27 細胞侵襲的影響；采用Western blot 檢測BMP/Smad 信號通路相關蛋白表達量。

表1 miR-149 引物設計Tab.1 miR-149 primer design

1.4 統計學方法采用t檢驗分析兩組間差異，P＜0.05 為差異有統計學意義，數據均用SPSS 22.0進行統計分析。

2 結果

2.1 miR-149在舌鱗狀細胞癌細胞的表達情況由圖1可知，CAL-27 和Tac8113細胞中的miR-149 mRNA表達水平相較ATCC細胞顯著下調（t=3.562、3.642，P＜0.05）；CAL-27 和Tac8113 細胞中miR-149-mim 組的miR-149 mRNA 表達水平相較miR-149-con 組顯著下調（t=9.535、9.672，P＜0.01）。

2.2 miR-149對舌鱗狀細胞癌細胞增殖的影響由圖2可知，miR-149-con組和miR-149-mim組CAL-27細胞增殖速度分別為（101.13±24.22）%、（75.41±14.56）%，故miR-149-mim 組CAL-27 細胞增殖速度相較miR-149-con 組顯著下調（t=3.322，P＜0.05）；miR-149-con組和miR-149-mim組Tac8113細胞增殖速度分別為（101.83±27.16）%、（73.25±16.25）%，故miR-149-mim 組Tac8113 細胞增殖速度相較miR-149-con 組顯著下調（t=3.354，P＜0.05）。

圖1 miR-149 在舌鱗狀細胞癌細胞的表達情況Fig.1 Expression of miR-149 in tongue squamous cell carcinoma

圖2 miR-149 對舌鱗狀細胞癌細胞增殖的影響Fig.2 Effect of miR-149 on the proliferation of tongue squamous cell carcinoma cells

2.3 miR-149 對舌鱗狀細胞癌細胞侵襲的影響由圖3可知，miR-149-con 組和miR-149-mim 組CAL-27侵襲細胞個數分別為（71.58±7.36）、（19.23±3.82），故miR-149-mim 組的CAL-27 細胞侵襲個數相較miR-149-con 組顯著下調（t=3.884，P＜0.05）；miR-149-con 組和miR-149-mim 組Tac8113 細胞侵襲個數分別為（77.49±9.11）、（24.15±3.89），故miR-149-mim 組Tac8113 細胞侵襲個數相較miR-149-con 組顯著下調（t=3.892，P＜0.05）。

圖3 miR-149 對舌鱗狀細胞癌細胞侵襲的影響Fig.3 Effect of miR-149 on the invasion of tongue squamous cell carcinoma

2.4 BMP/Smad 信號通路相關蛋白表達水平由圖4可知，miR-149-mim 組的CAL-27 細胞BMP-2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8 表達水平相較miR-149-con組顯著下調（t=3.225、3.188、3.354，P＜0.05）。miR-149-mim 組的TAC8113 細胞BMP-2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8 表達水平相較miR-149-con 組顯著下調（t=3.243、3.196、3.368，P＜0.05）。

圖4 BMP/Smad 信號通路相關蛋白表達水平Fig.4 Expression level of proteins related to BMP/Smad signal pathway

3 討論

本研究以Tca8113 和CAL-27 作為考查對象，分別分為miR-149-con 組和miR-149-mim 組，研究miR-149通過BMP/Smad信號通路對舌鱗狀細胞癌細胞增殖侵襲的影響。熒光定量PCR 實驗測定結果發現CAL-27 細胞中的miR-149 mRNA 表達水平相較ATCC 細胞顯著下調（P＜0.05）；Tac8113 細胞中的miR-149 mRNA 表達水平相較ATCC 細胞顯著下調（P＜0.05）；miR-149-mim 組CAL-27 細胞miR-149 mRNA 表達水平相較miR-149-con 組顯著下調（P＜0.01）；miR-149-mim 組Tac8113 細胞miR-149 mRNA 表達水平相較miR-149-con 組顯著下調（P＜0.01）。MTT 法檢測結果發現miR-149-mim 組CAL-27細胞增殖速度相較miR-149-con組顯著下調（P＜0.05）；miR-149-mim 組Tac8113 細胞增殖速度相較miR-149-con組顯著下調（P＜0.05）。Transwell細胞侵襲實驗檢測結果發現miR-149-mim 組的CAL-27細胞侵襲個數相較miR-149-con組顯著下調（P＜0.05）；miR-149-mim 組Tac8113 細胞侵襲個數相較miR-149-con 組顯著下調（P＜0.05）。Western blot 檢測結果發現miR-149-mim 組的CAL-27 細胞BMP-2 表達水平、Smad1/5/8 表達水平和p-Smad1/5/8表達水平相較miR-149-con組顯著下調（P＜0.05）；miR-149-mim 組的TAC8113 細胞BMP-2、Smad1/5/8和p-Smad1/5/8 表達水平相較miR-149-con 組顯著下調（P＜0.05），說明miR-249 對Tca8113 和CAL-27 增殖和侵襲的影響與激活BMP/Smad 信號通路有關。

TSCC 惡性程度高，生長快，浸潤性強，且早期易發生淋巴結轉移［11］。CHEN 等［12］研究異嗜性和多性逆轉錄病毒受體1（XPR1）發現，與正常舌頭組織相比，TSCC 組織中的XPR1 明顯上調。XPR1的高表達與TSCC的惡性特征和較差的患者存活率顯著相關。XPR1 的異位表達增加，而XPR1 的沉默則降低TSCC 細胞的增殖、侵襲和抗凋亡能力。YANG 等［13］研究發現神經周浸潤（PNI）是TSCC、口腔癌的不良預后因素。在控制T 期和病理分化后，PNI 仍然是宮頸淋巴結轉移（CLNM）、局部復發、頸部復發和疾病特異性生存（DSS）的獨立預測因子。END 也不能改善PNI 患者的頸部控制或DSS。REN 等［14］研究發現TSCC 細胞系和組織中長非編碼RNA 在大腸癌的差異表達（CRNDE）上調。CRNDE 的過表達增加了TSCC 細胞增殖、細胞周期和細胞侵襲。此外，CRNDE 的異位表達抑制了SCC1 細胞中miR-384 的表達，并增加了Kirsten Ras（KRAS），細胞分裂周期42 和胰島素受體底物1的表達，這是miR-384 的直接靶基因。與配對的相鄰非腫瘤樣品相比，TSCC 樣品中的miR-384 表達下調。SHI 等［15-17］研究發現TSCC 組織和細胞系中miR-488 的水平顯著降低，而ATF3 的表達顯著提高。引入miR-488 可以顯著抑制TSCC 細胞的侵襲和上皮-間質轉化（EMT），而敲低miR-488 則可以促進這兩個過程。ATF3 是miR-488 的潛在靶基因且miR-488 可以直接靶向ATF3。ATF3 沉默與miR-488 在TSCC 細胞上的過表達具有相似的作用。TSCC 細胞中ATF3 的過度表達部分逆轉了miR-488 模擬物的抑制作用。miR-488通過直接下調ATF3表達來抑制TSCC細胞的侵襲和EMT。

綜上所述，本研究結果顯示過表達miR-149可以通過激活BMP/Smad 信號通路實現對TSCC細胞增殖侵襲的抑制作用。研究尚存在不足之處：本研究并未對miR-149 調控BMP/Smad 信號通路介導TSCC 細胞生物學行為變化過程中涉及的具體細胞因子、靶基因以及機制進行具體分析，此外miR-149 對TSCC 細胞周期的影響仍需要進行后續試驗的深入研究。