基于微陣列技術分析胚胎停育絨毛組織中的染色體異常

侯東霞 侯麗青 烏云塔娜 周雪原 王曉華 冀小平

內蒙古自治區婦幼保健院（呼和浩特010060）

胚胎停育（embryo damage）是指在胎兒在母體子宮內發育少于20 周即死亡的現象，是常見的惡性圍產醫學疾病。胚胎停育有正常的早孕表現，可有或無先兆流產癥狀，可發展為自然流產、不全流產或稽留流產［1］。大約有15%～20%妊娠以早期自然流產而告終［2］，發病率高。造成胚胎停育的原因很多，包括胚胎染色體異常、母體內分泌紊亂、母體免疫失調、精子DNA 完整性和環境因素等［3-4］。其中，染色體異常被認為是最主要的因素。研究表明，約50%的胚胎停育絨毛組織存在染色體異常［5］。G 顯帶核型分析或免疫熒光原位雜交技術（FISH）是絨毛組織染色體異常檢測的常用手段，但兩種技術都有一定的局限性。G 顯帶核型分析需要細胞培養且只能檢出染色體數目或大片段的結構異常，FISH 則只能檢測有限的染色體數目異常，會漏檢一些染色體異常。近幾年發展起來的染色體微陣列技術（chromosomal microarray analysis，CMA），只需獲得DNA，就可全面、快速的檢出全部染色體的數目異常及非平衡性結構異常，即染色體片段的缺失或重復，也稱為拷貝數變異（copy number variation，CNV）。本研究基于CMA 分析胚胎停育絨毛組織的染色體異常，不僅分析了以往檢測技術能檢出的染色體數目異常和大片段結構異常，還分析了小片段的CNV，以及其他罕見的染色體異常類型，更全面的研究了胚胎停育和染色體異常的關系，進一步分析了孕婦年齡、流產次數差異，包含拷貝數在內的染色體異常分布情況。也進一步探討CMA 在胚胎停育遺傳學診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年10月至2020年5月在本院確診為胚胎停育（包括自然流產和稽留流產），并行清宮術及絨毛組織染色體異常檢測的自然受孕孕婦324 例。孕婦年齡為20～43 歲，平均（30±4）歲，孕周6～14 周。患有子宮內膜異位癥、子宮肌瘤等影響胚胎著床、發育的，以及男方精子不成熟的胚胎停育患者不納入研究。本研究經醫院倫理委員會批準（2018 倫函審［011］號），所有受檢者均已簽署知情同意書。

1.2 標本采集及DNA 提取將新鮮絨毛組織標本浸泡在裝有無菌等滲氯化鈉溶液離心管內，并用大量等滲氯化鈉溶液清洗3 次，去除血液等雜物。用組織剪取少部分絨毛組織，并將其剪碎。使用Promega 公司（美國）DNA 提取試劑盒，按照說明書提取基因組DNA。用NanoDrop 2000 分光光度計測定DNA 濃度。

1.3 染色體微陣列檢測使用Thermo fisher 公司（美國）CytoScanTMOptima 芯片，按試劑盒說明書操作，將基因組DNA 經酶切、接頭連接、PCR、產物純化、片段化、標記、預雜交之后，雜交液注入芯片，進行過夜雜交。次日，芯片經洗滌、染色和掃描獲得數據，用ChAS 軟件分析。將基因組拷貝數變異與收錄正常人群拷貝數變異的DGV 數據庫（http：//projects.tcag.ca/variationriatio）比對，并查詢表型數據庫DECIPHER（https：//decipher.sanger.ac.uk/）、ClinGene、PUBMED 數據庫等，并參考2019年CNV 解讀標準［6］進行解讀。

1.4 統計學方法應用SPSS 23.0 軟件進行數據統計，計量資料采用（）表示；計數資料采用例（%）表示，組間比較應用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 絨毛組織染色體異常檢出率共收集324 例絨毛組織，采用染色體微整列分析法檢測100%成功，檢出異常199 例，異常總檢出率為61.42%。其中，染色體數目異常172 例，檢出率為53.09%。CNV 21例，檢出率為6.48%。其他異常6例，檢出率為1.85%。199 例異常病例中，染色體數目異常和結構異常分別占比86.43%和10.55%。染色體數目異常以常染色體三體最多（126/199，63.32%）。常染色體三體包含了多重三體6 例、嵌合體三體7 例、嵌合體多重三體2 例。6 例其他異常，包括染色體三體和CNV 合并異常2 例，三倍體基礎上的非整倍體2 例（68，XYY，-4 和70，XXX，+16），雜合性缺失（LOH）1 例，異源嵌合（46.XX/46，XY）1 例，異常占比為3.02%。見表1。

表1 胚胎停育絨毛組織染色體異常檢出情況Tab.1 Detection of chromosomal abnormalities in fetal villous tissue of embryo damage

2.2 染色體非整倍體分析常染色體三體、常染色體單體、性染色體單體和合并三體和結構異常的病例共159 例，均屬于染色體非整倍體。分析這些非整倍體異常中每條染色體的發生異常的頻率，見表2。常染色體多數以三體發生常見，少數發生單體。其中，16-三體發生率最高為23.90%（38/159），其次為22-三體（19/159，11.95%）、15-三體（17/159，10.69%）和21-三體（14/159，8.8%）等。性染色體異常以X 單體為常見，發生率為17.61%（28/159）。本次收集的樣本中，有19 條出現了非整倍體異常，1、17、19 號常染色體和Y 染色體未發現非整倍體異常。

2.3 低齡孕婦與高齡孕婦染色體異常分布將樣本以預產年齡35 歲為界限分為低齡組和高齡組來分析。324 例樣本中，低齡組孕婦275 例，平均年齡（29±2）歲，染色體異常164 例；高齡組孕婦49 例，平均年齡（37±2）歲，染色體異常35 例；異常率分別為59.64%和71.43%，高齡組異常率高于低齡組，但兩組染色體異常率差異無統計學意義（χ2=2.441，P=0.118）。比較不同類型染色體異常的分布差異，兩組間常染色體三體（χ2=14.450，P＜0.001）和CNV（χ2=5.010，P=0.025），差異有統計學意義，見表3。染色體三體在高齡組異常占比高達91.43%，低齡組中為57.32%；CNV 在低齡組中異常占比12.80%，高齡組異常中未發現。常染色體單體、性染色體單體和三倍體在低齡組中分布率均高于高齡組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。各染色體三體在高齡組和低齡組中的分布見圖1，13、15、21、22 號染色體在高齡組三體異常占比更高，而16-三體在低齡組占比更高，但差異均無統計學意義（P＞0.05）

表2 各染色體非整倍體異常發生頻次Tab.2 The frequency of aneuploid abnormality of each chromosome

表3 高齡孕婦與低齡孕婦染色體異常分布情況Tab.3 Distribution of chromosomal abnormalities in older and younger pregnant women 例（%）

圖1 高齡孕婦與低齡孕婦常染色體三體的分布情況Fig.1 Distribution of autosomal trisomy in older and younger pregnant women

2.4 多次胚胎停育染色體異常情況324 例樣本中有4 例胚胎停育≥2 次，其中3 例異常，且均為常染色體三體，異常率75%；與單次胚胎停育的染色體異常率（196/320，61.25%）差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 胚胎停育樣本中發現的拷貝數變異共檢出21 例CNV，通過查詢數據庫判斷其致病性，其中16 例為致病性，3 例為可能致病，2 例為臨床意義未明。21 例中有10 例同時發生兩個或兩個以上位點的CNV。同一病例具有多個致病性不同的CNV 時，以致病性最強的作為評價。按片段長度來分析，有12 例（57.14%）CNV＞10 Mb，全部為致病性變異；2 例（9.52%）CNV 大小在5～10 Mb 之間，為可能致病變異；7 例（33.33%）CNV＜5 Mb，4 例為致病性變異，1 例為可能致病變異。大部分CNV 有與之相關連的疾病報道，這些疾病可導致多種發育問題。21 例病例均未收集到其父母驗證結果。見表4。

3 討論

胚胎停育是婦產科常見疾病，以自然流產或稽留流產為妊娠結局。胚胎停育病因多而復雜，其中染色體異常是公認的最主要的致病因素。流產組織絨毛染色體的檢測，是尋找胚胎停育病因的有效手段，不僅能夠為生育困難患者提供遺傳指導，還有助于推動流產病理學的臨床研究。本研究分析324 例胚胎停育絨毛組織樣本，顯示染色體異常率為61.42%，較大多數早期自然流產、稽留流產等胚胎停育相關文獻報道的異常率（50%～70%）［4-5，7-10］偏高。這一結果說明約60%的胚胎停育病例可以在遺傳方面找到病因，根據具體的染色體異常將得到有效的生育指導。

表4 胚胎停育絨毛組織中發現的CNVTab.4 The CNVs found in aborted villous tissue of embryo damage

一般染色體異常分為數目異常和結構異常。數目異常是臨床上最常見的染色體畸變類型。胚胎停育染色體異常研究報道中染色體數目畸變的異常占比普遍可達90%左右，其中非整倍體三體最多，可達60%以上［5，8-10］，本研究的檢出率與之相似。非整倍體主要是由卵母細胞或精子成熟過程中或受精卵早期卵裂過程中染色體不分離或丟失造成的［11］。通常來說，三體最常見且種類最多。除了1 號染色體外，所有染色體的三體都在流產組織中被發現［5］，本研究中1、17、19 號染色體未發現三體。一般16-三體的發生率最高，在自然流產的染色體三體病例中約占20%～30%［5，8-9］。16-三體與胎兒死亡、早產、宮內發育遲緩和胎兒畸形高度相關［12］。發生率較高的還包括22-三體、21-三體和15-三體，13-三體和18-三體發生率也相對較高但低于前述4 條染色體［5，8-10］。本研究中，各染色體異常頻次統計顯示16-三體發生頻次最高，其次為22、15、21、13-三體，但并未發現18-三體。Turner 綜合征（45，XO）是性染色體數目異常最常見的類型［8-10］，本研究檢出率較其他文獻報道稍高，同時并未見其他種類的性染色體異常。但事實上47，XXX、47，XXY、47，XYY 和47，XYYY 在流產絨毛組織中也可被檢測到［9-10］。常染色體單體發生率一般較低，本研究偶見18 單體兩例和21 單體1 例。整倍性異常也常見于流產絨毛組織中［8-10］，可發生三倍體或四倍體，本研究采用方法僅可檢出三倍體。三倍體是致死性的，其形成可能來自于雙雌受精或雙雄受精。雙雌受精是指二倍體卵細胞的受精，通常是由于卵細胞未排出極體或第二極體重新融合到卵細胞；雙雄受精即兩個精子同時進入了卵細胞［13］。多倍體的發生率遠低于非整倍體，這可能與兩類異常發生的機制不同有關。

染色體結構異常包括染色體片段的重復、缺失、倒位和易位，在流產組織染色體總體異常中所占的比例約為5%～13%［8-10］，本研究檢出為10.55%。結構異常的檢出率受到檢測方法的影響，一般CMA方法檢出率高于傳統核型分析。常規染色體核型分析僅能發現＞5～10 Mb 片段的結構異常，而CMA 能檢出染色體微小片段（＞100 Kb）的缺失或重復，但無法檢出平衡易位或倒位等無DNA 片段缺失或重復的染色體結構異常。本研究檢出的21 例結構異常，有7 例缺失或重復的片段＜5 Mb，有4例含有5～10 Mb的片段，這些是常規核型分析方法不能或不易發現的。基于本研究檢測結果，在流產組織中CMA 至少能比傳統方法多檢出33.33%（7/21）的染色體結構異常。本研究中發現的流產絨毛組織的染色體片結構異常多數同時存在重復和缺失，且發生在不同的染色上，形成多重結構異常。根據2019年新版CNV 解讀標準［6］，較大片段的缺失重復評分均＞0.99，可以認定其為明確的致病性變異，但本研究中也有5 例可能致病或臨床意義不明的小片段缺失或重復病例，需要未來臨床數據的進一步積累或相關基因功能的研究來提供證據明確其致病性。

胚胎停育涉及到的染色體異常類型復雜，這些異常包括但不限于染色體三體、單體、多倍體、染色體嵌合、染色體結構重排列及拷貝數變異等［14］。同一病例攜多重染色體異常的情況并不少見［8-10］，如本研究中發現的多重三體、三體合并CNV 異常、三倍體非整倍體。此外，LOH 也是胚胎停育的致病原因［15-16］，但較少見，本研究發現1 例。本研究還發現1 例46，XX/46，XY 異源嵌合，也稱真兩性畸形或開米拉。根據文獻資料及本研究的分析結果，使用CMA 方法更大程度上的找出了胚胎停育的遺傳學病因。CMA 檢測胚胎停育的病因需要更多的臨床研究來補充積累，有廣闊的發展和創新空間。

隨著年齡的增加，女性的流產次數及其胎兒染色體異常率都會隨之增高［17］。本研究發現高齡組的染色體異常率（71.43%）遠高于低齡組（59.64%），差異主要表現在常染色體三體和CNV 異常上。高齡組的三體比率可達90%。Soler 等在980 例自然流產組織中分析母親年齡與染色體異常的關系，發現高齡孕婦中染色體異常率顯著高于低齡孕婦，異常率從61.3%增加至76.8%［18］。本研究進一步分析了各染色體三體在高、低齡孕婦中的分布，但這可能受到樣本量的限制，因此差異均無統計學意義。本研究中CNV 異常在低齡孕婦的染色體異常占比較高，而高齡孕婦中未見此類異常。ZHANG 等［19］報道在胎兒或流產組織中，非整倍體和CNV 的發生率隨孕婦年齡的增加而增加。按照一般的認識孕婦年齡越大發生染色體異常機率越高，推測本研究與文獻結果相異的主要原因可能是高齡組樣本量少，這還需要更大樣本量的研究來驗證。LEI 等［20］發現孕婦年齡越高，胎兒羊水染色體核型45，X 的發生率反而越低。本研究發現45，X 的發生率同樣是在低齡孕婦中更高，但差異無統計學意義。除三體和CNV 異常外的其他幾種染色體異常在高齡和低齡比較中差異均無統計學意義，可能和高齡組樣本量的較少有關，還需要后期再擴大樣本數進行研究，使結果更具有可靠性。

偶發性流產在早孕期是常見的，但連續兩到三次的反復妊娠損失的現象并不常見。一些研究稱偶發性流產和反復流產其妊娠產物的染色體異常率差異無統計學意義［21］。但也有一些研究聲明復發性流產的染色體異常率要低于偶發性流產［5］，因為偶發性流產可認為主要是異常胚胎向生存能力發展的失敗，與染色體異常關聯更為密切，而復發性流產包含更多的其他病因。綜合多個研究結果，反復流產的染色體異常率與自然流產的異常率相似［21-22］。ZHANG 等［23］研究了696 例流產患者反復流產的病因構成，發現兩次或三次以上復發性流產的病因構成一致。本研究分析顯示單次與多次胚胎停育染色體異常率差異無統計學意義。但因多次胚胎停育樣本量較少，所以此次分析結果并不能充分說明多次胚胎停育與單次胚胎停育染色體異常的差異，這也是本研究的不足之處。

綜上所述，通過染色體檢測可為半數以上的胚胎停育患者找到病因，除了最常見的染色體數目異常，CNV 也是一個重要的致病原因。CMA 作為新興的分子核型分析技術，能更高效且準確地分析胚胎停育組織染色體的數目和非平衡結構變異，檢出傳統染色體診斷技術無法檢測到的微缺失微重復，提高染色體異常的檢出率。未來應該繼續研究CMA 對胚胎停育中染色體結構異常的檢出率，并積累致病CNV 的數據，為臨床提供更加準確和豐富的參考。總之，CMA 技術的應用有利于胚胎停育的臨床診斷和指導患者再生育，提高了臨床染色體病的診斷水平。