L1細胞黏附分子在結腸癌中表達的臨床意義和生物學作用

陳立智 胡軍 傅厚豐 符敏

瓊海市人民醫(yī)院普通外科（海南瓊海571400）

結腸癌（colon cancer，CC）是中國第四常見的惡性腫瘤，每年新增CC 病例超過130 000 例，占我國癌癥死亡人數的10%［1-2］。統(tǒng)計數據顯示目前約有54%的CC 確診病例未發(fā)生轉移（Dukes A&B期），46%的病例有遠處淋巴結或器官轉移（Dukes C&D 期）［3-4］。近些年，雖然改良的外科技術、輔助放射治療以及經肝動脈栓塞化療等在CC 轉移治療中取得一定進展，但大多數進展期的CC 患者最終死于轉移性疾病［5-6］，因此尋找結腸癌遠處轉移的治療靶點是延長結腸癌患者生存期重要策略。

L1細胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule，L1CAM）又名CD171，是一種細胞黏附的免疫球蛋白超家族分子［7-8］，L1CAM 在神經系統(tǒng)的軸突引導和細胞遷移中起著至關重要的作用，其突變易發(fā)生多種神經系統(tǒng)疾病［9-10］。L1CAM 被質膜附近的胰蛋白酶、金屬蛋白酶等酶裂解水解后會生成可溶式入胞片段L1-ICD，然后與細胞骨架蛋白、肌動蛋白、血影蛋白相互作用后驅使細胞向遠處轉移［11-12］。最近多項研究表明L1CAM 在膠質母細胞瘤、肺癌、胃癌等多種實體瘤中高表達，促進腫瘤細胞轉移和侵襲等生物學行為，并與患者不良預后相關［13-16］。然而，L1CAM 在CC 中的表達及其與臨床預后的關系卻鮮有報道。本研究系統(tǒng)地評估了L1CAM 在166 例CC 組織中表達情況，還設計一系列體外實驗研究L1CAM 在CC 中的生物學特性，以綜合評價L1CAM 對CC 患者預后影響和生物標志物潛力。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2010年3月至2016年3月期間在我院收治并經病理證實的166 例結腸癌患者。其中，男92 例，平均年齡為（58.62±14.21）歲。女74 例，平均年齡為（59.27±16.31）歲。所有入組病例術前未接受過放、化療，且均有詳細的臨床資料和手術記錄。本研究按照1964年《赫爾辛基宣言》的倫理標準和隨后的所有修訂進行。且得到瓊海市人民醫(yī)院倫理委員會審核和批準，患者和對照者在納入本研究之前均知情同意。

1.2 免疫組織化學檢測L1CAM 表達于我院病理科取4 μm 厚度的石蠟切片；切片經二甲苯脫蠟、水化；5%的Triton 透化30 min，加入檸檬酸緩沖液（pH 6.0），微波抗原修復15 min 后，用3%的H2O2去離子水孵育10 min 阻斷內源性過氧化酶的作用；10%正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育10 min；滴加100 μL L1CAM 一抗（1∶200 稀釋，Abcam，貨號：ab24345，美國）于4 ℃孵育過夜，以PBS 作一抗為陰性對照。次日，PBS 沖洗玻片，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育30 min；用GT Vision 抗體復合物（抗鼠/兔）法和GT VisionI檢測系統(tǒng)試劑盒（上海基因技術有限公司）進行染色。以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性表達。每張切片隨機選取10 個不同的視野，在顯微鏡下隨機捕獲多個圖像，分析每個視野的陽性細胞數并計算陽性率。

細胞質被染上棕黃色或棕褐色的記為陽性細胞。參照MATTERN 等提到的方法，從兩方面進行半定量評分：（1）染色深淺度。未見染色為0，輕度染色為1，中度染色為2，深度染色3。（2）染色細胞的百分比：未見染色細胞為0，染色細胞＜25%為1，染色細胞25%～50%為2，染色細胞＞50%為3。將這兩方面評分相加計總分（0～6 分）。當評分為0～2 分則為陰性，超過2 分則為陽性。

1.3 細胞培養(yǎng)和小分子RNA（si-RNA）轉染人CC細胞HCT116 和LS174T 細胞株及正常上皮細胞NCM460 和FHC 細胞購于中國科學院上海細胞庫。細胞培養(yǎng)于T25 cm3的培養(yǎng)瓶中。加入5 mL 的DMEM高糖培基（Gibco，美國）、10%胎牛血清（FBS，Gibco，美國）、100 U/mL 青霉素鈉和100 μg/mL 鏈霉素（Hyclone，美國）。細胞培養(yǎng)瓶放于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中。

靶向敲除人源L1CAM 的序列：正義鏈：5′-CGGCAGGCATTAGAG ATGAACAGCA-3′；反義鏈：3′-AGGCCCAUAACCACTCAGCCTAG-5′。以同一廠家（銳博生物，廣州）提供的與人類基因沒有同源性的陰性對照發(fā)夾siRNA 作為陰性對照。將1.5×105個細胞接種于35 mm 培養(yǎng)皿中24 h，用脂質體Lipo 3 000 試劑（賽默飛公司，美國）轉染。24 h檢測轉染效率，提取細胞蛋白并進行功能實驗檢測。

1.4 Western blot檢測L1CAM表達將細胞種于6 孔板中，待其融合度達到90%左右時，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 含有蛋白酶抑制劑Cocktail的蛋白裂解液RIPA。吸取細胞裂解液于EP 管中，4 ℃12 000 g 離心30 min。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度（上海碧云天生物技術）。40 μg總蛋白由SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉移到0.45 μm 厚度的PVDF 膜上。于4 ℃孵育L1CAM 和GAPDH 一抗（1∶1 000，Abcam，貨號：ab 24345，美國）過夜。次日，條帶與相應的辣根過氧化物酶標記的二抗體室溫孵育1 h（1∶5 000；上海碧云天生物技術）。用ECL 增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，加州，美國）對膜進行可視化，并用凝膠分析儀進行了灰度分析。目標蛋白的相對含量為目標蛋白與相應的內參條帶灰度值比值。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力將對照組（control，Con）和 轉 染si-L1CAM 組 的HC116 和LS174T 細胞種于6 孔板中，待融合度達到90%左右時，用200 μL 的Tip 槍頭進行劃痕，PBS 沖洗3 次洗去脫落的細胞。加入新鮮的完全培養(yǎng)基。用倒置顯微鏡捕獲同一區(qū)域0 h 和48 h 的劃痕的圖片（10 倍），該實驗重復3 次，測量劃痕區(qū)細胞之間的距離的遷移能力進行量化。

1.6 細胞增殖和凋亡檢測CCK8 檢測細胞增殖：取對數生長期的細胞，以1 × 103/孔細胞接種于96 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。于6、12、24、48 和72 h 后開始進行CCK 8 實驗，每孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋好的CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育2 h，于酶標儀450 nm 處測吸光值，每組3 個復孔，連續(xù)測量3 d，繪制生長曲線圖。

流式細胞儀測凋亡：本實驗采用細胞凋亡試劑盒（BD science，芝加哥，美國）進行檢測。細胞在轉染2 d 后被消化離心，用冰PBS 洗滌兩次，重懸于100 μL 的1X Bing buffer 中，分別加入5 μL 的PI 和Anexin V 試劑，室溫避光孵育15 min。然后在1 h 之內送至本院科研中心進行上機檢測。細胞凋亡細胞率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.7 統(tǒng)計方法用GraphPad Prism software（Version 5.01，GraphPad 軟件公司，圣地亞哥，智利）統(tǒng)計軟件進行分析。采用獨立樣本t檢驗比較兩組樣本間各指標的差異。采用卡方檢驗分析L1CAM 蛋白的陽性率和患者臨床病理變量之間的關系。選擇過程來發(fā)現L1CAM 表達的獨立危險因素使用Kaplan-Meier 方法繪制總體生存（overall survival，OS）曲線，并使用Log-rank 檢驗進行分析。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 L1CAM 在結腸癌中高表達免疫組化檢測結腸癌組織和癌旁組織中LICAM 蛋白表達結果如圖1所示，LICAM 蛋白在結腸癌組織中主要定位于細胞質，著棕褐色的細胞定義為陽性表達。根據評分，在入組的166 例結腸癌組織中125（75.30%）例為LICAM 陽性表達。在癌旁組織中LICAM 的陽性表達為41 例，陽性率為24.70%。兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 L1CAM 高表達與CC 患者臨床病理特征的關系由表1可知，L1CAM 表達與CC 患者性別、年齡無關（P＞0.05）。然而L1CAM 表達和腫瘤直徑、分化程度及患者淋巴轉移和臨床分期顯著相關（P＜0.05）。其中，相比于淋巴結未轉移的患者，淋巴結轉移組的患者的組織中L1CAM蛋白的陽性率更高（P＜0.05）。此外，Ⅲ-Ⅳ患者組織中L1CAM 蛋白的表達顯著高于Ⅰ-Ⅱ患者（P＜0.05）。

圖1 IHC 檢查CC 組織和癌旁組織中L1CAM 的表達（×200 倍）Fig.1 IHC examination of L1CAM expression in colon cancer tissues and adjacent tissues（×200）

表1 L1CAM 的表達與CC 患者臨床病理特征的關系Tab.1 The relationship between L1CAM expression and clinicopathological features of patients with CC 例

2.3 L1CAM表達與CC患者病理因素的相關性在Cox 風險比例模型分析中，L1CAM 表達（P＜0.001）、腫瘤大小（P＜0.001）、淋巴結轉移（P＜0.001）、分化程度（P＜0.001）、更高的臨床分期（P＜0.001）為CC 患者的獨立風險預后因素。相反，性別、年齡不是CC 患者的獨立風險預后因素。由圖2可知，L1CAM 高表達組的OS 中位生存期為18.5 個月，而L1CAM 低表達組的OS 中位生存期為25.23 個月，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008）。提示L1CAM 高表達預示結腸癌患者的不良預后。

表2 Cox 風險比例模型分析CC 患者的獨立預后風險因素Tab.2 Cox risk proportional model analysis of independent prognostic risk factors for patients with CC

圖2 L1CAM 高低表達組患者的OS 生存曲線Fig.2 OS survival curves in patients with L1CAM high and low expression group

2.4 敲除L1CAM 降低CC 細胞遷移能力為了探索L1CAM 的在CC 中的生物學作用，選擇具有較高侵襲性的結腸癌細胞系HCT116 和LS174T。同時選取了正常結腸上皮細胞系FHC 和NCM460作為對照。由圖3A可知，相比于FHC 和NCM460，CC 細胞系HCT116 和LS174T 內源性L1CAM 表達水平顯著升高（P＜0.05）。進一步探究L1CAM對CC細胞的正向調控作用，利用si-RNA 建立HCT116和LS174T 細胞L1CAM 低表達模型。結果如圖3B所示，si-L1CAM 組的L1CAM 蛋白表達較對照組顯著降低（P＜0.05）。細胞遷移實驗結果表明，與對照組相比，L1CAM 低表達組CC 細胞的遷移距離明顯縮短。

2.5 敲除L1CAM 促進CC 細胞凋亡L1CAM 敲除后，HCT116和LS174T的細胞凋亡率顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖5A-B。此外，采用CCK8 檢測細胞增殖結果提示L1CAM 敲除后兩株細胞的增殖率顯著下降（P＜0.05），見圖5C。

3 討論

在這一回顧性分析中，采用IHC 方法檢測了166 例CC 患者癌和癌旁配對組織中L1CAM 的蛋白表達，以評價L1CAM 在CC 中的作用。本研究發(fā)現在75.30% CC 組織中存在L1CAM 蛋白陽性表達，而24.7%CC組織L1CAM蛋白陰性表達。其中，Ⅲ～Ⅳ級患者組織中L1CAM 蛋白的表達顯著高于Ⅰ～Ⅱ級患者。MOHANAN 等［17］發(fā)現L1CAM 蛋白水平與膠質瘤臨床病理分級顯著相關，本研究結果與其一致。此外，相比于未發(fā)生淋巴結轉移的患者，淋巴結轉移的患者的組織中L1CAM 蛋白的陽性率更高。與以往的研究一致，在乳腺癌的研究表明L1-CAM 的表達主要發(fā)生在乳腺癌組織的侵襲性前沿和血管內皮細胞，這提示L1CAM 在癌癥的惡性進展和侵襲性中起作用。在隨后的多因素分析中，發(fā)現L1CAM 蛋白水平（95%CI：0.943～2.774，P＜0.001）、腫瘤直徑（95%CI：0.092～1.107，P＜0.001）、分化程度（95%CI：0.873～1.454，P＜0.001）、淋巴結轉移（95%CI：0.910～2.031，P＜0.001）、臨床分期（95%CI：0.617～1.732，P＜0.001）是影響CC 患者生存的獨立因素，且L1CAM陽性組患者與L1CAM 陰性組患者相比，OS 較差（18.5vs.25.23，P=0.008），這提示L1CAM 在CC 的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色。另外，腫瘤標志物常作為腫瘤篩查和復發(fā)轉移監(jiān)測的重要手段［18］，以上多因素分析結果還提示L1CAM 具有發(fā)展成為監(jiān)測結腸癌術后復發(fā)和轉移的標記物的潛在價值。

然而，目前尚未見更深入的細胞水平研究。為了更進一步探討L1CAM 在CC 的生物學關系，根據本研究的臨床結果L1CAM 似乎與CC 的侵襲性相關，而與腫瘤的生長無顯著相關。因此選擇了具有較高侵襲性的結腸癌細胞系HCT116和LS174T。同時選取了正常結腸上皮細胞系FHC和NCM460 作為對照。采用si-RNA 干擾技術檢查了細胞的遷移能力變化。值得注意的是，敲除L1CAM 顯著降低CC 細胞的遷移能力。之前的研究表明，L1CAM 陽性與血管侵犯有關，且認為L1CAM 陽性腫瘤細胞對腫瘤血管的親和力高于淋巴管［19］。在本研究中，發(fā)現異常活化的L1CAM陽性腫瘤細胞的淋巴結轉移能力顯著升高。根據相關研究進展，認為這可能是以下原因：（1）與L1CAM 在腫瘤細胞中表達的因子相互作用，包括整合素、神經肽-1 或L1CAM 本身，導致腫瘤細胞通過細胞-細胞相互作用遷移。（2）近來研究顯示，L1CAM 的細胞外結構域包含SL1，其可通過崩解劑ADAM10 和金屬蛋白酶ADAM17 介導的切割從細胞表面脫落［20］。一些研究發(fā)現，乳腺、黑色素瘤、膠質瘤和卵巢癌細胞會通過自分泌或旁分泌刺激作用釋放SL1 到血液中，然后發(fā)揮腫瘤歸巢效應，加速腫瘤轉移。（3）L1CAM 破壞含有E-cadherin 的粘附連接，增加MCF7 乳腺癌細胞的散射和運動，這種表型似乎與EMT 的機制密切相關［19］。隨后，WHITTARD［21］發(fā)現L1CAM 的表達與上皮間充質轉換（EMT）、MAPK、JNK 和ERK 信號相關，導致腫瘤細胞存活、遷移、侵襲和耐藥的產生。

圖3 敲除L1CAM 降低CC 細胞遷移能力Fig.3 Knockout of L1CAM reduces CC cell migration

圖4 敲除L1CAM 對CC 細胞凋亡和增殖的影響Fig.4 The effect of knocking out L1CAM on apoptosis and proliferation of CC cells

本研究尚存在一些不足之處，雖然OS 曲線結果分析表明L1CAM 的高表達對結腸癌患者的預后不良，但是治療方式對OS 曲線存在部分影響，本研究樣本病例和隨訪時間較短，沒有分別對化療和未化療患者中L1CAM 高、低表達的OS 進行分析，所以在今后的研究工作中要進行多中心研究、擴大樣本，延長隨訪周期，規(guī)避OS 生存分析的影響因素。另外，L1CAM 促進轉移的作用機制沒有進行深入的研究，雖然在其他腫瘤有研究報道，但對L1CAM 促結腸癌轉移機制并沒有很重要的參考意義，因此在今后的研究中將通過多組學的方法多維度尋找L1CAM 促進結腸癌轉移機制，并利用分子生物學方法多層次進行驗證。

綜上所述，本研究結果顯示L1CAM 蛋白在人結腸癌組織中高表達，導致患者不良預后，并能夠促進結腸癌增殖和轉移，提示L1CAM 蛋白可發(fā)展為結腸癌患者診斷和預后的一個分子指標，并為臨床治療結腸癌提供一定的理論基礎。