姜黃素二聚體載藥納米粒的制備與性能研究

文納川，劉珍寶2，杜沛芳，侯姣姣，劉艷飛

(1.中南大學化學化工學院，湖南長沙，410083；2.中南大學湘雅藥學院，湖南長沙，410013)

姜黃素(CUR)是一種從姜黃中分離出來的植物化學物質，因其對膀胱癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等具有抗腫瘤效果[1-3]，以及對正常組織細胞具有低毒性，近年來引起了人們極大的研究興趣并被廣泛用于癌癥治療[4]。研究表明，姜黃素具有很好的抗癌活性。然而，姜黃素的藥代動力學性質差，存在水溶性低、代謝速度快，消除速度快和生物利用度低的缺陷，而常規通過脂質體或聚合物等包封CUR 制成納米粒，雖在一定程度上能延長體循環，提高生物利用度，但載藥量不理想[5]，包封藥物的大量載體材料存在材料相關的毒性、代謝及降解問題[6]，目前鮮有CUR高載藥量的納米載藥體系的報道。自2015年CAI等[6]闡述藥物制成二聚體形式的聚合物納米粒子具有特別高的載藥量和包封率后，人們對藥物綴合成二聚體前藥結構的研究產生了極大興趣。PEI等[7-8]設計了二聚體藥物綴合物，并將其用作納米核心構成單元，形成具有二聚體藥物核心的聚合物納米粒子。這種方法一般能將藥物載藥量從低于10%提高到50%以上，如PEI 等[7]合成的PEG-b-PDLLA載PTX 二聚體載藥量達到了85%；FANG 等[9]開發了基于二聚喜樹堿甘油磷酸膽堿(di-CPT-GPC)前藥的喜樹堿(CPT)的新脂質體制劑載藥量達到了62%。人們對姜黃素構建二聚體的研究很少，一般藥物構成二聚體都是通過酯鍵或酰胺鍵與含二硫鍵的響應子連接[7-9]。姜黃素因具備酚羥基，可通過酯鍵連接響應型結構域，因此，可以通過二聚體形式解決姜黃素載藥量問題。該二聚體能在腫瘤的微環境解聚，發揮姜黃素的抗癌活性。同時，研究表明納米粒子的粒徑對其體循環穩定性、腫瘤部位的積累與穿透都有很大影響，已報道粒度大于200 nm 的納米粒容易被補體系統及網狀內皮系統快速清除[10-11]，而小于5 nm的微小納米粒容易被腎臟排泄和腎小球濾過清理[12-13]，且只有大于50 nm的粒子才能有效地通過EPR效應實現腫瘤積累，并隨著粒徑的增大腫瘤滲透能力降低[14-15]，因此，抗腫瘤載藥納米粒適宜的粒徑為50～100 nm。本文作者通過合成姜黃素二聚體，并以PEGPLGA 為載體，通過乳化溶劑揮發法制備(CUR2-TK)PEG-PLGA納米粒，并探討納米粒制備工藝中藥物聚合物比例等對納米粒性能的影響，在提高載藥效率的同時控制得到最佳粒徑，并對藥物的體外釋藥進行研究。

1 實驗

1.1 樣品與試劑

姜黃素粉末(西安昌岳生物生產)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、4-二甲氨基吡啶、三巰基丙酸(上海安耐吉化學生產)；聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)(相對分子質量為20 000，其中，PEG和PLGA的相對分子質量分別為5 000和15 000，山東岱罡生物生產)；其他試劑和溶劑均為分析純。

1.2 姜黃素二聚體的制備

將無水3-巰基丙酸(5.31 g，50 mmol)和無水丙酮(5.81 g，100 mmol)加入25 mL 三頸燒瓶中，然后用1 mL 三氟乙酸(TFA)催化。在室溫下攪拌3 h后，將燒瓶置于冷卻的冰浴中進行產物結晶并過夜。抽濾過濾晶體，用正己烷和冷水沖洗。在真空烘箱中干燥得到白色產物縮硫酮TK[16]。

通過一鍋反應制備姜黃素二聚體[17]，將CUR(姜黃素，80.0 mg，0.22 mmol)溶解在20 mL CH2Cl2中，然后加入縮硫酮TK(25.2 mg，0.1 mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)(76.8 mg，0.40 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(2.5 mg，0.02 mmol)。于30 ℃下攪拌1 h之 后，加 入EDC·HCl(38.4 mg，0.20 mmol)和DMAP(2.5 mg，0.02 mmol)，并在相同條件下攪拌反應24 h。反應后，旋轉蒸發有機溶劑，再溶于3 mL 二甲基亞砜與12 mL 純水中，使用透析膜(500 D，MWCO)透析24 h 除去小分子雜質，反應產物以CH2Cl2與MeOH的體積比為94:6為洗脫液，用硅膠柱層析法純化，凍干得到深紅色產物。

1.3 納米粒的制備

使用溶劑揮發法制備(CUR2-TK)PEG-PLGA NPs[18]。分別將30 mg CUR2-TK 溶解在0.3 mL DMSO 中，將60，30，15 和10 mg PEG-PLGA 溶解在1 mL二氯甲烷中(其中，m(CUR2-TK):m(PEGPLGA)分別為1:2，1:1，2:1和3:1，m為質量)，然后，將二者混合后逐滴加入10 mL 質量分數為1%的聚乙烯醇(PVA)溶液中，使用超聲液體破碎儀(SONICS-VCX500)超聲混合3 min，再加入40 mL 質量分數為0.1% PVA 溶液中，在轉速為600 r/min 磁力下攪拌4 h，揮發有機溶劑，然后用10 000 r/min 低溫離心15 min，并用蒸餾水洗滌重復3次，收集(CUR2-TK)PEG-PLGA NPs納米粒子，凍干24 h，產物NPs儲存在-20 ℃冰箱中。

1.4 納米粒表征

通過納米粒的形態、粒度、多分散系數、zeta電位、納米粒載藥量和包封率來對不同配比下合成的納米粒(m(CUR2-TK):m(PEG-PLGA)為1:2，1:1，2:1 和3:1)進行表征：采用馬爾文粒度分析儀(Malvern Zeta-sizer Nano)對粒徑和多分散指數(PDI)進行表征；采用透射電鏡TEM(Tecnai G2 20S-Twin，FEI Czech Republic)研究納米粒子形態；考察聚合物分子結構和載藥納米粒子制備條件對納米粒子粒徑的影響，通過調節載藥條件對粒徑性能進行調控，考察不同投料比下納米粒的載藥量與包封率；取冷凍干燥載藥納米粒加入二氯甲烷，離心、取上清液，采用紫外分光光度法計算納米粒中藥物的載藥量與包封率。

1.5 體外釋藥性能研究

采用智能藥物溶出儀進行納米粒體外釋放的性能研究。準確稱取100 mg 載藥納米粒，置于透析袋中(2 000 D，MWCO)，再加入5 mL pH=7.3的磷酸緩沖溶液，扎緊兩端，加入釋放液pH=7.3 的磷酸緩沖溶液500 mL。調節溫度為37 ℃，轉速為130 r/min，每隔一定時間取5 mL 釋放液，在波長415 nm處測定紫外吸光度，同時補充等量釋放液，根據標準曲線計算累積溶出率。

2 實驗結果與討論

2.1 姜黃素二聚體的合成分析

利用姜黃素的酚羥基與縮硫酮的羧基進行酯化反應生成姜黃素二聚體，將2個單分子姜黃素連接起來，其反應式如圖1所示。

圖1 姜黃素二聚體合成路線圖Fig.1 Synthesis route of curcumin dimer

圖2 CUR2-TK的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectrum of CUR2-TK

圖3 CUR2-TK的核磁共振氫譜圖Fig.3 1H NMR spectrum of CUR2-TK

通過紅外光譜(FTIR)和核磁共振氫譜(1HNMR)表征姜黃素二聚體，分別如圖2和圖3所示。FTIR 光譜(圖2)表明在1 627 cm-1附近的峰與羰基的C=O延伸有關；1 592，1 507和1 429 cm-1附近的峰是苯環的C=C 拉伸振動引起的。在CUR2-TK 的光譜中，在1 730 cm-1處出現了新的吸收峰，這是酯鍵形成引起的C=O 拉伸振動所致。姜黃素二聚體CUR2-TK 的1HNMR 譜(圖3)表明：在核磁共振氫譜中，在化學位移6～8之間的區域中存在CUR 芳族基團的多個特征性質子共振峰，化學位移2.5處的峰為氘代DMSO溶劑峰，化學位移3.3 處的峰為水峰，而作為插入的中間連接基團的縮硫酮TK 接頭的特征峰出現在化學位移1.62 和2.92處，這表明成功合成了目標產物。通過色譜柱純化，姜黃素二聚體CUR2-TK的產率為76.37%。

2.2 納米粒的制備與粒徑、形貌分析

姜黃素為疏水性藥物，因此，制備(CUR2-TK)PEG-PLGA 納米粒采用水包油(O/W)單乳液溶劑揮發法。在納米粒制備過程中，藥物姜黃素二聚體與載體PEG-PLGA 的質量比、油相DMSO 與二氯甲烷的用量、超聲攪拌的強度與時間、水分散相中穩定劑PVA 含量以及攪拌揮發有機溶劑的時間等因素都會影響最終制備的納米粒性質，為了能通過EPR 效應有效地實現腫瘤部位的藥物積累，并加強納米粒的腫瘤滲透能力，需要嚴格控制納米粒的粒徑，粒徑為50～100 nm的納米粒能達到最佳的腫瘤攝取效率。通過對實驗條件的探索，確定得到納米級納米粒的最佳條件如下：油相聚合物PEG-PLGA 在二氯甲烷溶劑中的質量分數為2.2%，水分散相中PVA的質量分數為1%，油相與水相以質量比為1.3:10 進行超聲攪拌3 min，再加入質量分數為0.1%的PVA水溶液中以600 r/min的攪拌速度揮發有機溶劑4 h，可以得到粒徑小于100 nm的納米粒。

通過透射電鏡觀察制備的(CUR2-TK)PEGPLGA納米粒，納米粒水溶液的TEM照片如圖4所示。從圖4可以發現：納米粒為球形結構，較為圓整，粒度較均一，表明獲得了穩定的、具有良好球形的納米粒。圖4(a)所示為在m(CUR2-TK):m(PEG-PLGA)=1:2 條件下制備的納米粒的透射電鏡圖。從圖4(a)可以發現納米粒的平均粒徑約為40 nm，而當m(CUR2-TK):m(PEG-PLGA)由1:2 逐漸增加到3:1 時，納米粒的平均粒徑逐漸增加到76 nm左右，這表明隨著疏水性藥物姜黃素二聚體的增加，制備的納米粒粒徑隨之增大。

采用馬爾文粒度分析儀(Malvern Zeta-sizer Nano)對制備的納米粒的水合粒徑與多分散系數進行表征，DLS粒徑分析結果如圖5所示，其結果與透射電鏡觀察到的納米粒粒徑較為吻合。在m(CUR2-TK):m(PEG-PLGA)分別為1:2，1:1，2:1和3:1 的情況下，平均水合粒徑分別為(41.0±2.4)，(47.8±3.1)，(58.3±4.5)和(76.6±5.3)nm，表明隨著藥物姜黃素二聚體含量的增加，納米粒的粒徑隨之增大。圖6所示為多分散系數PDI隨藥物姜黃素二聚體含量增加而增大，不同投料比下的多分散系數分別為0.168±0.009，0.215±0.013，0.323±0.021 和0.409±0.025，表明隨著載藥量增加，粒徑均一性變差。

圖4 載藥納米粒的TEM圖像Fig.4 TEM images of(CUR2-TK)PEG-PLGA NPs

圖5 不同藥物、賦形劑投料比下納米粒的粒徑Fig.5 Size with different mass ratios of CUR2-TK and PEG-PLGA

圖6 不同藥物、賦形劑投料比下納米粒的多分散系數(PDI)變化Fig.6 PDI with different mass ratios of CUR2-TK and PEG-PLGA

2.3 納米粒的載藥量與包封率

疏水性藥物單體負載于聚合物的載藥量通常為10%左右，姜黃素也是如此。而將藥物單體合成二聚體后，載藥量可大幅增加到50%以上。因此，通過藥物姜黃素二聚體CUR2-TK 與聚合物PEG-PLGA 以不同的質量比制備納米粒，其載藥量與包封率隨m(CUR2-TK):m(PEG-PLGA)的變化如表1所示。

影響納米粒的載藥量與包封率的主要因素為藥物CUR2-TK 與聚合物PEG-PLGA 的投料比。為了提高藥物的載藥量，減少賦形劑的使用及其毒性，需要在加大藥物占比的同時保證一定的包封率。不同CUR2-TK 與PEG-PLGA 投料比下的納米粒載藥量和包封率見表1。從表1可知：隨著CUR2-TK質量的增加，納米粒的載藥量逐步提高，但包封率隨之降低。這可能歸因于CUR2-TK 比例的增加使O/W 體系中CUR2-TK 的濃度梯度增大；隨著濃度梯度的作用，更多的藥物CUR2-TK 擴散至水相而未被油相包裹，因而造成藥物損失，這意味著隨m(CUR2-TK):m(PEG-PLGA)增加，藥物在O/W 體系中的濃度增大，因而包封率減小。結果顯示，當藥物與聚合物投料質量比為3:1時，載藥效率高達(61.9±2.9)%，遠超常規姜黃素單體構建的10%左右的載藥量[5,19-20]；包封率為(80.1±3.8)%，變化不明顯；且該投料比下得到的納米粒粒徑較均一，平均粒徑為76 nm，表明該實驗條件下制備的姜黃素二聚體納米粒具有比較好的應用潛力。

表1 不同CUR2-TK與PEG-PLGA投料比下納米粒載藥量和包封率Table1 Drug loding and encapsulation efficiency with different mass ratios of CUR2-TK and PEG-PLGA

2.4 納米粒的體外藥物釋放性能

(CUR2-TK)PEG-PLGA 納米粒的體外釋藥研究在pH 為7.3 時的磷酸緩沖溶液中進行，采用m(CUR2-TK):m(PEG-PLGA)=3:1 組進行釋藥研究。圖7(a)所示為納米粒累積藥物釋放度Qt與時間t的特性關系。從圖7(a)可知：在開始階段，由于納米粒膜內外高的藥物濃度差，導致藥物迅速擴散，釋藥速率達到頂峰；隨著濃度差減小，轉變為緩釋階段，經100 h釋藥后，累積藥物釋放度Qt達到(84.87±3.15)%。

圖7(b)所示為t1/2與累積藥物釋放度Qt的擬合直線。從圖7(b)可知其與Higuchi 釋藥模型相關性很好，釋藥模型擬合結果表明納米粒在此緩沖液中的釋放符合Higuchi 方程：Qt=14.45+6.95t1/2(相關系數R=0.998)。

圖7 載藥納米粒的體外釋放曲線和擬合直線Fig.7 Release profiles of CUR2-TK from drug loaded nanoparticles and linear fitting chart

3 結論

1)合成了姜黃素二聚體CUR2-TK，并以此為藥物單元，以聚合物PEG-PLGA 作為藥物載體，通過單乳液溶劑揮發法制備了(CUR2-TK)PEGPLGA納米納米粒。

2)探討了納米粒制備過程中不同實驗條件對納米粒性能的影響，確定了優化后的實驗條件，提高了姜黃素載藥量。通過投料比調節，納米粒載藥量和包封率分別達到(61.9%±2.9)%和(80.1%±3.8)%，納米粒形貌規整較均一，平均粒徑為76 nm左右，且藥物緩釋時間達4 d以上。

3)(CUR2-TK)PEG-PLGA 納米粒有效提高了姜黃素的載藥量，減少了載體的使用及可能的毒性，且粒徑可控制在50～100 nm之間，在增強腫瘤部位積累的同時有較強的腫瘤穿透能力，可望作為一種抗腫瘤的藥物傳遞系統。