丁苯酞對(duì)急性腦梗死大鼠血液流變學(xué)及血清同型半胱氨酸水平的影響

閆欣 江濤 李娜 唐彥

(河北省保定市第二中心醫(yī)院，河北保定 072750)

急性腦梗死(ACI)是一種臨床常見(jiàn)的腦血管疾病[1]，提高腦梗死的治愈率將是人們面臨的主要任務(wù)。大量研究表明，在腦缺血和缺氧后24h 內(nèi)，大量血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NF)發(fā)生應(yīng)激增殖，并在缺血性半影區(qū)中開(kāi)始產(chǎn)生大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞，并擴(kuò)展到梗塞區(qū)域[2,3]。而血液粘度增加和紅細(xì)胞聚集是溶栓和患者死亡后第二次血栓形成的主要原因[4]。因此，有效降低血液粘度并減少炎癥反應(yīng)以改善高凝狀態(tài)具有重要意義，可降低溶栓后再出血風(fēng)險(xiǎn)。

丁苯酞（DL-3-正丁基酞，NBP）是首先在我國(guó)上市的一類新藥[5]，對(duì)急性缺血性中風(fēng)具有治療作用[6]。NBP 可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受由缺血和缺氧引起的損傷，神經(jīng)功能缺損、腦缺血和記憶損害[7]。超敏C 反應(yīng)蛋白(hs-CRP)是中風(fēng)等腦部疾病的危險(xiǎn)因素之一。為進(jìn)一步研究NBP 在腦梗死治療中的價(jià)值，著重分析了NBP 對(duì)血液流變學(xué)、血清同型半胱氨酸水平和hs-CRP 及血管內(nèi)皮因子這些指標(biāo)的影響，以及NBP 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，以期為ACI 有效治療方案提供理論參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立和處理分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性Sprague-Dawley 大鼠（8 周齡，250～300g），購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海醫(yī)學(xué)研究院，將其喂養(yǎng)在籠子里，在晝夜節(jié)律的室溫下喂食。將大鼠分為(CK,n=10)、ACI 組(ACI,n=10)和藥物組(ACI+NBP,n=10)，三組均接受相同的飲食。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用戊巴比妥鈉(70mg/kg)處死。所有動(dòng)物程序均按照動(dòng)物研究指南進(jìn)行，并由醫(yī)院委員會(huì)審查并批準(zhǔn)。

1.2 血漿Hcy 的檢測(cè)及檢測(cè)設(shè)備

經(jīng)過(guò)1 夜禁食后，空腹收集大鼠血液樣本。將樣品儲(chǔ)存在-80℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。血漿樣本通過(guò)高壓液相色譜法檢測(cè)Hcy 的濃度，參考Ozdem 等[8]方法。儀器設(shè)備：K2025 高效液相色譜儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）。

1.3 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中VEGF 和hs-CRP 的水平

將100μL 樣品稀釋液和血清添加到每個(gè)孔中，然后在37℃的恒溫箱中保溫1.5h。隨后，將100μL 生物素標(biāo)記的抗體工作溶液添加到每個(gè)孔中，在37℃下孵育1h。之后，將100μL 的抗生物素蛋白-HRP 標(biāo)記的工作溶液添加到每個(gè)孔中，在37℃下孵育30min。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS; Gibco,Grand Island,NY,USA)洗滌3次后，將TMB（3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）底物溶液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)洗滌加入以終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度。最后，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算VEGF 和hs-CRP 的水平。

1.4 TUNEL 法檢測(cè)大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡

將腦組織切片用4%多聚甲醛固定，用PBS 洗滌3 次，并逐滴添加50μL TdT 酶反應(yīng)溶液。隨后滴加50μL 鏈霉親和素-TRITC 標(biāo)記溶液，在黑暗中孵育30min。用PBS 洗滌3 次后，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)保留細(xì)胞核，然后在室溫下孵育15min。最后，在顯微鏡下觀察染色。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

均采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。首先進(jìn)行方差的均一性，然后進(jìn)行t檢驗(yàn)以比較兩組之間的差異。單向方差分析用于比較不同組之間的差異，然后進(jìn)行事后檢驗(yàn)（最低顯著性差異）。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NBP 對(duì)ACI 大鼠腦神經(jīng)元凋亡的影響

通過(guò)TUNEL 染色法檢測(cè)了ACI 大鼠腦神經(jīng)元凋亡，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，ACI 大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加（圖1），而使用NBP 處理后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況得到了緩解，基本恢復(fù)到CK組水平。

2.2 大鼠中紅細(xì)胞壓積和血沉的變化

對(duì)大鼠紅細(xì)胞壓積和血沉進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK 組相比，ACI 大鼠紅細(xì)胞壓積由37.4%顯著增加至42.7%，而使用NBP 后紅細(xì)胞壓積恢復(fù)到37.9%，接近CK 組 狀態(tài)（圖2A，P＜0.01）。在血沉檢測(cè)結(jié)果中，ACI 大鼠血沉由15.52mm/h 增加到18.86mm/h（圖2B），且在NBP 處理后顯著降低至16.18mm/h（P＜0.01）。

圖1 NBP 對(duì)ACI 大鼠腦神經(jīng)元凋亡的影響

圖2 ACI 大鼠中紅細(xì)胞壓積（A）和血沉（B）的變化情況

2.3 血漿黏度和纖維蛋白原含量水平的變化

對(duì)大鼠血漿粘度檢測(cè)結(jié)果如圖3A，ACI 大鼠中血漿粘度和假手術(shù)組（CK）對(duì)照相比有顯著的升高，并在NBP 處理后恢復(fù)初始水平（P＜0.01）。相似的，ACI 大鼠中纖維蛋白原也由較低水平的2.98mg/L 顯著增加至3.66mg/L，而在ACI+NBP 組則顯著降至2.68mg/L（圖3B，P＜0.01）。這些結(jié)果說(shuō)明，NBP能夠顯著改善ACI 大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)，從而對(duì)大鼠起到保護(hù)作用。

圖3 ACI大鼠中血漿黏度（A）和纖維蛋白原含量水平（B）的變化情況

2.4 血清同型半胱氨酸水平的變化

同型半胱氨酸（Hcy）是評(píng)價(jià)ACI 的重要指標(biāo)，利用高效液相色譜儀檢測(cè)了不同分組大鼠血清Hcy水平，結(jié)果如圖4 所示。與CK 組相比，ACI 大鼠血清中Hcy 含量顯著提高約1.6 倍（P＜0.01），而ACI+NBP 組大鼠中則與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明NBP 能有效減少ACI 大鼠Hcy 水平，有效保護(hù)ACI 大鼠。

圖4 ACI 大鼠中血清同型半胱氨酸水平的變化情況

2.5 血管內(nèi)皮因子和超敏感C 反應(yīng)蛋白水平的變化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性，還對(duì)大鼠血管內(nèi)皮因子(VEGF)和hs-CRP 水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果：ACI 大鼠VEGF 含量較對(duì)照組顯著增加約1.2倍（P＜0.01），而ACI+NBP 組大鼠VEGF 則與CK組無(wú)顯著差異（圖5A）。同樣，hs-CRP 檢測(cè)結(jié)果與VEGF 結(jié)果類似，NBP 的處理顯著降低其在ACI大鼠中的高表達(dá)（圖5B，P＜0.01），從而有效緩解了ACI 的癥狀。

圖5 ACI 大鼠VEGF（A）含量和hs-CRP（B）水平的變化

3 討論

我國(guó)是腦血管疾病高發(fā)國(guó)家[9]，缺血性腦血管疾病的發(fā)病率占腦血管疾病的70%～80%，且腦梗死死亡率和致殘率相對(duì)較高[10]。因此，疾病嚴(yán)重程度的早期評(píng)估、及時(shí)的針對(duì)性治療已成為腦梗死研究重點(diǎn)[11]。

He 等[12]指出，DL-NBP 對(duì)創(chuàng)傷性脊髓損傷具有神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明DLNBP 可以顯著增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎性因子的釋放，提高脊髓損傷的運(yùn)動(dòng)能力，并減少大鼠模型腔內(nèi)脊髓損傷的面積。Zhao 等[13]發(fā)現(xiàn)DL-NBP 對(duì)腦外傷具有良好的治療作用，同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明，用DL-NBP 治療后損傷周圍區(qū)域的凋亡因子水平顯著降低。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)用NBP 處理后ACI 大鼠中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著減少，說(shuō)明其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有有效地抑制作用，從而保護(hù)腦組織細(xì)胞免受損傷。研究結(jié)果還顯示，用NBP 治療后的ACI 大鼠中紅細(xì)胞壓積、血沉、血漿黏度和纖維蛋白原均顯著低于對(duì)照組，由此表明NBP 具有促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用及能有效改善ACI 大鼠的血液流變學(xué)性質(zhì)。以對(duì)ACI 大鼠起到保護(hù)作用。

Hcy 是在蛋氨酸代謝過(guò)程中形成的一種含硫非蛋白質(zhì)氨基酸[14]，是動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病發(fā)病的危險(xiǎn)因子之一。已證實(shí)Hcy 與許多疾病密切相關(guān)[15]。總血漿Hcy 升高被稱為高同型半胱氨酸血癥（HHcy）。研究證明HHcy 可減輕內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)毒性半胱氨酸加合物代謝并維持氧化應(yīng)激[16]。

hs-CRP是腦梗死患者炎癥反應(yīng)重要指標(biāo)之一，hs-CRP 水平的提高能夠有效指示炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，是腦梗死患者預(yù)后不良的高危因素之一[17,18]報(bào)道，hs-CRP 的增加對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展與脫落具有顯著促進(jìn)作用[19]。而血管內(nèi)皮因子(VEGF)主要作用是調(diào)節(jié)機(jī)體血管滲透性，在機(jī)體腦組織缺氧情況下，活化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞，能夠分泌VEGF，從而加重患者缺血腦組織水腫[20]。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NBP 能夠有效的降低大鼠因ACI 引起的VEGF 和hs-CRP 水平急劇增加的情況，抑制了其顯著的增加，從而有效的緩解腦梗死大鼠炎癥和血管內(nèi)皮功能。給予ACI 大鼠NBP治療有助于神經(jīng)功能修復(fù)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，改善ACI 大鼠血液流變學(xué)和同型半胱氨酸水平，以及影響血管內(nèi)皮功能和超敏C 反應(yīng)蛋白水平，從而改善ACI 大鼠的生存質(zhì)量。